ПІДСУМКИ ВИНАХОДУ

Даний винахід відноситься до дієтичної композиції для діагностики та боротьби з харчовою алергією у тварин-компаньонів, таких як собаки та коти, і, зокрема, до гіпоалергенної дієтичної композиції, яка використовує гідролізований білок як єдине джерело білка.

Постійною проблемою у ветеринарній спільноті є діагностика та лікування харчової алергії у тварин-компаньонів, таких як собаки та коти. Харчова алергія часто призводить до шкірних та шлунково-кишкових захворювань у собак, які можуть розвивати харчову гіперчутливість у віці від 2 місяців до 12 років. Інші симптоми, пов’язані з харчовою алергією у собак, включають хронічну діарею, порушення всмоктування поживних речовин, втрату ваги, біль у животі та млявість.

Основними харчовими алергенами є водорозчинні глікопротеїни з молекулярною масою від 10 000 до 60 000 дальтон. Основними причинами харчової гіперчутливості у собак є молочні продукти, яловичина та рослинні білки, тоді як у котів переважна харчова гіперчутливість до риби та молочних продуктів.

Діагностика харчової алергії у тварин включала такі процедури, як внутрішньошкірне шкірне тестування з харчовими алергенами або серологічне тестування, таке як радіоалергосорбент (RAST) або імуноферментні аналізи (ІФА). Однак такі методи були визнані ненадійними. В даний час діагностика харчової алергії, як правило, вимагає поміщення тварини на домашню елімінаційну дієту, яка, як правило, займає багато часу і незручно. Наприклад, тварина повинна перебувати на елімінаційній дієті протягом періодів від 3 до 10 тижнів.

Поширеним методом лікування харчової гіперчутливості є суворе уникання. Однак уникнення може бути важко досягти у тварин-компаньонів, оскільки домашні дієти, приготовані незручно, джерела білка, такі як баранина, важко придбати, а комерційні дієти можуть мати приховані антигени. Крім того, тривале годування одним або кількома новими джерелами білка може призвести до розвитку гіперчутливості до цього білка. Хоча кортикостероїди можуть зменшити клінічні ознаки, хронічне застосування може мати довгостроковий згубний вплив на собак та котів.

Встановлено, що алергенні властивості білків можна зменшити ферментативним гідролізом білків у пептиди. Дослідження показали, що дієти, складені з гідролізованим білком, зменшать антигенне навантаження та зменшать алергічні реакції у моделях харчової алергії. Частково гідролізовані дієти використовувались для немовлят з високим ризиком та для профілактики клінічних ознак харчової гіперчутливості у собак та котів. Більшість цих дієт використовують гідролізовані молочні продукти (казеїн) або рослинні білки (соєвий білок). Однак такі дослідження не вказують на ступінь гідролізу, необхідного для запобігання алергічної реакції у тварин. Попередні дослідження також не вказують на відповідні джерела білка для використання в раціоні тварин-компаньонів.

Ще одним фактором, який слід враховувати при розробці гіпоалергенної дієти для тварин-компаньонів, є включення джерела клітковини, що призводить до прийнятного утворення стільця, уникаючи будь-якої потенційної алергії. Наприклад, бурякова м’якоть є загальновживаним джерелом клітковини у продуктах для тварин, що містять білки, які можуть викликати алергічну реакцію.

Відповідно, у цій галузі все ще існує дієтична композиція для тварин-компаньонів, таких як собаки та коти, яка дозволяє діагностувати та лікувати харчову алергію у таких тварин, забезпечуючи при цьому прийнятне утворення стільця.

Даний винахід задовольняє цю потребу, забезпечуючи гіпоалергенну дієтичну композицію для тварин-компаньонів, таких як коти та собаки, які можуть бути використані для діагностики та лікування харчової алергії. Дієтична композиція включає гідролізований білок як єдине джерело білка в їжі для зменшення вироблення антигену та алергічних реакцій, а також джерело клітковини, що забезпечує прийнятне утворення стільця.

Відповідно до одного аспекту цього винаходу пропонується гіпоалергенна дієтична композиція для тварин-компаньонів, що містить, на основі сухої речовини, джерело білка, джерело жиру та вуглеводи, де джерело білка складається з приблизно від 20 до 30% за вагою на основі сухої речовини гідролізованого білка. Гідролізований білок переважно містить гідролізовану курячу печінку. Переважно, щонайменше 99% білка має молекулярну масу менше 1,5 кДа.

Джерелом вуглеводів переважно є маніока, яка становить приблизно від 50 до 60% за вагою на основі сухої речовини композиції.

Композиція переважно додатково містить приблизно від 1 до 5 мас.% На основі сухої речовини джерела волокна, вибраного із групи, що складається з яблучного волокна, волокна гороху, суміші карбоксиметилцелюлози (КМЦ) та стійкого крохмалю та їх сумішей.

Коли композицію за цим винаходом вводять тваринам-супутникам у кількості та частоті, що відповідають їх харчовим потребам, було виявлено, що тварини демонструють знижену продукцію антигену. Композиція цього винаходу може також використовуватися для забезпечення способу діагностики харчової алергії у тварини-компаньйона. Наприклад, тварина, яка відчуває алергічні симптоми, може бути посаджена на дієту згідно з цим винаходом протягом декількох тижнів, і якщо симптоми пом'якшуються, наявність харчової алергії підтверджується, і тварина може згодовуватися різними джерелами білка для визначення специфічне джерело алергії.

Відповідно, особливістю цього винаходу є створення гіпоалергенної дієтичної композиції та способу діагностики харчової алергії у тварин-компаньонів. Інші особливості та переваги винаходу будуть очевидні з наступного опису, доданих креслень та доданої формули винаходу.

Фіг. Фіг.1 - гістограма, що показує шкірні реакції собак, яких годували різними гідролізованими дієтами, включаючи гіпоалергенну дієту цього винаходу; і

Фіг. Фіг.2 - стовпчаста діаграма, що відображає реакції слизової оболонки шлунка собак, які харчуються гідролізованими дієтами, показаними на фіг. 1.

Гіпоалергенна дієтична композиція за цим винаходом забезпечує покращення порівняно з наявними дієтичними композиціями, оскільки композиція використовує гідролізований білок як єдине джерело білка, що забезпечує ефективний метод діагностики харчової алергії у тварин-компаньонів. Крім того, композиція включає джерело клітковини, яке не викликає подальшого потенціалу алергічної реакції і яке забезпечує прийнятне утворення стільця.

Ми виявили, що дієтична композиція за цим винаходом зменшує вироблення антигену у тварини і виконує такі ж чи кращі результати, ніж інші комерційно доступні гіпоалергенні дієти, щодо демонстрації реакції або ступеня реакції.

Дієтична композиція може бути надана у будь-якій придатній формі, якщо вона містить бажану концентрацію гідролізованого білка на основі сухої речовини. Наприклад, композиція може бути екструдована та консервована або забезпечена у вигляді бісквіта.

Композиція переважно містить приблизно від 9 до 30 мас.% Жиру, від 50 до 60 мас.% Вуглеводів і приблизно від 20 до 30 мас.% Гідролізованого джерела білка, все на основі сухої речовини. Крім того, композиція переважно включає приблизно від 1 до 5 мас.% Джерела клітковини, вибраної з яблучного волокна, волокна гороху, суміші карбоксиметилцелюлози та стійкого крохмалю та їх сумішей.

Джерелом гідролізованого білка в композиції переважно є гідролізована куряча печінка. Композиція бажано сформульована таким чином, щоб щонайменше 99% джерела білка мали молекулярну масу менше 1,5 кДа, щоб гарантувати, що відбувся гідроліз настільки, що запобігти алергічну реакцію.

Джерело вуглеводів переважно містить маніоку, але може включати й інші джерела, такі як картопляне борошно, овес та ячмінь.

Джерело жиру переважно включає жир тваринного походження, але може також включати жир птиці, риб’ячий жир, лляне масло і масло огуречника.

Для того, щоб винахід можна було легше зрозуміти, робиться посилання на наступні приклади, які призначені для ілюстрації винаходу, але не обмежують сферу його застосування.

Дієта була сформульована для собак, які використовували гідролізовану курячу печінку як джерело білка, а маніоку як джерело вуглеводів. Дієта була складена з 99,8% білка, що має молекулярну масу нижче 1,4 кілоДальтон (кДа), як показано нижче в таблиці 1.

З первинного дослідження смакових якостей було встановлено, що потрібно визначити джерело клітковини, яка має помірну ферментацію в шлунково-кишковому тракті собаки, але яка не спричинятиме алергічної реакції та призведе до прийнятного утворення стільця. Джерелами клітковини, що відповідають цим критеріям, були яблучне волокно, волокно гороху та комбінація CMC/стійкого крохмалю. Ці волокна були включені в дієти (див. Таблицю 4) і тестувались на вироблення стільця в біопробі. Загалом для цього біологічного дослідження було використано 12 собак (4 собаки на обробку). Собак годували відповідними дієтами протягом 21 дня, а показники калових мас реєстрували щодня. Результати узагальнені в таблиці 5. Дієта, сформульована з яблуком Pomace, привела до найкращо сформованого стільця.

Дієта з Прикладу 1 була випробувана для визначення її ефективності. Дієта, представлена в таблиці 6, представлена нижче.

Протокол. Дослідження проводились відповідно до NIH Посібник з догляду та використання лабораторних тварин та Канадська рада з питань тварин Керівництво по догляду за доглядом та використанням експериментальних тварин. Для цього дослідження використовували кросистих собачих собак (n = 14), тварин отримували з 3 послідів. Тварин випадковим чином розподіляли у 2 групи лікування протягом 24 годин після народження. Собаки 1 групи (n = 11) були сенсибілізовані до казеїну, курячої печінки та соєвого білка, а собаки 2 групи (n = 3) діяли як контролі і не були сенсибілізовані до будь-яких харчових антигенів.

Собак садили на дієту для щенят (The Iams Company, Дейтон, Огайо) протягом перших 6 місяців, а потім до кінця дослідження підтримували дієту для дорослих (The Iams Company, Дейтон, Огайо). Ці дієти не містили молочного білка, соєвого білка або курячої печінки. Собаки отримували дієти, що містять молочний білок, соєвий білок та курячу печінку протягом 4 тижнів у віці 11 місяців. Їжа забезпечувалась відповідно до рекомендацій виробників, а прісна вода - за бажанням. Щодня спостерігали за тваринами та реєстрували будь-які клінічні відхилення.

Харчові антигени/аналіз. Сенсибілізуючі антигени включали казеїн, соєвий білок та курячу печінку (1: 1: 1, залежно від ваги). Реакції гіперчутливості проводили на таких гідролізованих та інтактних дієтах: казеїн (Sigma), 1% гідролізований казеїн (Iams), 2% гідролізований казеїн (Iams), 5% гідролізований казеїн (Iams), 10% гідролізований казеїн (Iams), 20 % гідролізованого казеїну (Iams), 50% гідролізованого казеїну (Iams), куряча печінка, гідролізована куряча печінка (Iams), соєвий білок, Exclude® (гідролізований казеїн і печінка, 16,5% білка, DVM Pharmaceuticals, Маямі, Флорида), HA -Formula ™ (гідролізована соя, 18% білка, Ralston Purina, Сент-Луїс, Міссурі) та гідролізована дієта з курячої печінки (тестова дієта; 19% білка, The Iams Company, Льюїсбург, Огайо). Гідроліз казеїну та курячої печінки проводила компанія Iams (Льюїсбург, Огайо). Ступінь гідролізу, виражена у відсотках, представляє частку реакції гідролізу до вільних амінокислот.

Для того, щоб визначити молекулярну масу білків у тестових дієтах та сенсибілізуючих антигенах, проводили електрофорез SDS-PAGE. Кожен антиген готували, отримуючи 10% мас./Мас. суспензії або розчину з використанням дистильованої води та інтенсивно струшуючи протягом 1 години. Концентрацію білка визначали за допомогою системи аналізу BioRad (BioRad, Missisauga Ontario). Розчини регулювали так, щоб містити 2 мг/мл білка. Електрофорез SDS-PAGE проводили на 20% розділяючому гелі та 4% гелю для укладання при 200 В протягом 5,5 годин. На кожну смугу гелю завантажували десять мікрограмів білка.

Гелі SDS-PAGE розділяли білки між 5 і 80 кДа. Максимальна та мінімальна молекулярна маса, яку можна виявити для кожного зразка, наведена в таблиці 7.

У зразках 1%, 2% та 5% гідролізованого казеїну проводили мінімальний гідроліз високомолекулярних білків. Ці гідролізовані зразки суттєво не відрізнялись від одного лише казеїну. Значний гідроліз високомолекулярних білків був досягнутий у 10 і 20% зразках, але все ще існували дані про наявність деяких високомолекулярних білків. Конкретні казеїнові білки, такі як α-лактальбумін (14,2 кДа), можуть бути виявлені в 1–10% гідролізованих зразках казеїну. Повний гідроліз високомолекулярних білків, здається, був досягнутий у 50% гідролізованому зразку казеїну. Негідролізований казеїн мав велику кількість високомолекулярних білків. Як куряча печінка, так і гідролізована куряча печінка мають високомолекулярні смуги. Значний гідроліз білків був досягнутий у дієтах Exclude, HA-Formula та тестах, але слабкі високомолекулярні смуги все ще можна було виявити.

Протокол сенсибілізації. Протокол сенсибілізації для собак групи 1 передбачав підшкірне введення цуценятам живої вірусної вакцини (чума, гепатит, парвовірус, парагрип, Форт Додж Айерст, Гвельф Онтаріо) з подальшим підшкірним введенням харчового антигену в ад'ювант галун 10. Між день 1 та день 85, собаки 1 групи були сенсибілізовані 7 ін’єкціями 1 мг казеїну, соєвого білка та курячої печінки. Контрольні тварини отримували лише ад'ювант.

Шкірні проби. Шкірні тести проводили після того, як собаки виконали протокол сенсибілізації до сенсибілізуючих антигенів приблизно у віці 6 місяців. Шкірна гіперчутливість до досліджуваних дієт (казеїн, 1% гідролізований казеїн, 2% гідролізований казеїн, 5% гідролізований казеїн, 10% гідролізований казеїн, 20% гідролізований казеїн, 50% гідролізований казеїн, куряча печінка, гідролізована куряча печінка, соєвий білок, виключити, HA-Formula, тестова дієта) проводили приблизно у віці 10 місяців. Брюшний аспект живота використовувався для шкірного тестування кожного цуценя. Чотири концентрації харчового алергену (2000, 200, 20 та 0,02 мкг/мл) вводили внутрішньошкірно (0,05 мл). Гістамін у тій же концентрації, що і антигени, використовували як позитивний контроль, тоді як стерильний фізіологічний розчин - як негативний контроль. Барвник Evans blue (0,5%, 0,2 мл/кг) вводили внутрішньовенно через 5–10 хвилин після внутрішньошкірних ін’єкцій. Приблизно через 20 хвилин після внутрішньошкірних ін'єкцій вимірювали діаметр пшениці та реакцію спалаху кожного алергену.

Гастроскопічна харчова чутливість. Гастроскопічні обстеження проводили цуценятам у віці приблизно 6 місяців (після сенсибілізації) та 10 місяців (тестові дієти). Собакам знеболювали 2–3% галотаном після седації ацепромазином. Ендоскопію проводили за допомогою дитячого верхнього ендоскопа ШКТ з робочим каналом для ін’єкцій. Тестові антигени (такі ж, як шкірні проби, 0,5 мл, 1 мг/мл у фізіологічному розчині 1: 1 фізіологічний розчин/гліцерин) вводили в слизову шлунка за допомогою голки для склеротерапії. Контроль складався із сольового розчину/гліцерину. Барвник Evans blue (0,5%, 0,2 мл/кг) вводили внутрішньовенно внутрішньовенно за 5–10 хвилин до шлункових ін’єкцій. Реакції слизової оболонки шлунка на кожен антиген та контроль оцінювали через 5 хвилин після ін’єкції відповідно до ступеня набряку, еритеми та синього плями, використовуючи таку систему оцінки: 0 = нормальна слизова оболонка шлунка; 1 = незначна еритема; 2 = незначна еритема та набряк; 3 = помірна еритема та набряк; незначне синє вкраплення; 4 = виражена еритема та набряк; синє виправлення.

IgE в сироватці крові. Сироватку відбирали у контрольних та сенсибілізованих собак наприкінці протоколу сенсибілізації (вік 6 місяців). Концентрацію специфічних сироваткових антитіл IgE визначали за допомогою ІФА в комерційній діагностичній лабораторії (Biomedical Services, Austin, Texas). Титр IgE у сироватці крові порівнювали з великим пулом нормальних собак та собак із встановленою харчовою гіперчутливістю. Рівні IgE оцінювали як нормальні, прикордонні, позитивні та високопозитивні.

Сенсибілізація собак. Після того, як собаки пройшли протокол сенсибілізації, у 6-місячному віці вимірювали чутливість шкіри та шлункові реакції на сенсибілізуючі антигени. Було встановлено, що всі собаки були успішно сенсибілізовані до казеїну, соєвого борошна та антигенів курячої печінки. Контрольних тварин не сенсибілізували.

Клінічна оцінка. Коли собак садили на дієти, що складалися з сої, казеїну та курячої печінки у віці 11 місяців, у всіх сенсибілізованих собак розвивався понос середньої та кількох діаметрів та втрачалася вага (дані не наведені). Крім того, 8 з 11 сенсибілізованих собак продемонстрували дерматологічні реакції, які включали випадання волосся та свербіж шлунка. У контрольних собак не спостерігалось дерматологічних реакцій. Клінічні ознаки розвивались протягом першого тижня годування сенсибілізуючої дієти і зберігалися до тих пір, поки дієта була передбачена.

Структура реакцій слизової шлунка на досліджувані дієтичні антигени була подібною до тієї, що спостерігалася після шкірних ін’єкцій. У сенсибілізованих собак лише 50% гідролізований казеїн, HA-формула, Exclude та тестова дієта мали гастроскопічні показники значно нижчі, ніж негідролізовані антигени (Фіг. 2). Тестова дієта була найменш реактивною з усіх викликаючих антигенів. Гастроскопічні показники контрольних собак були нормальними або незначними для всіх антигенів (ФІГ. 2).

Результати. Результати дослідження показують, що для усунення реакцій гіперчутливості необхідний високий ступінь гідролізу білка (до 50% повного гідролізу). Менший ступінь гідролізу може посилити алергічні реакції, оскільки антигенні епітопи в 3-мірній структурі білків піддаються імунологічній обробці.

Собаки не реагували на комерційні гіпоалергенні гідролізовані дієти (дієта Exclude або HA-Formula), які містять суміші на основі молока/печінки та сої. Тестова дієта забезпечила найменше шкірних та слизових реакцій із трьох сенсибілізованих дієт.

Незважаючи на те, що для ілюстрування винаходу були показані певні репрезентативні варіанти здійснення та деталі, для фахівця в даній галузі буде очевидно, що різні зміни в способах та пристроях, розкритих у цьому документі, можуть бути внесені, не виходячи за рамки винаходу, який є визначені у доданій формулі винаходу.