Вплив дієти з високим вмістом жиру на імплантацію ембріонів самкам щурів, що зазнали дії бісфенолу А 1

Алан М. Мартінес

5 Відділ репродуктивної ендокринології та безпліддя, Кафедра акушерства та гінекології, Медичний коледж Університету Цинциннаті, Цинциннаті, штат Огайо

Ана Чонг

6 Відділ екологічної генетики та молекулярної токсикології, Департамент охорони навколишнього середовища, Медичний коледж Університету Цинциннаті, Цинциннаті, штат Огайо

7 Центр екологічної генетики, Медичний коледж Університету Цинциннаті, Цинциннаті, штат Огайо

Джун Інь

8 Відділ біостатистики та біоінформатики, Департамент охорони навколишнього середовища, Медичний коледж Університету Цинциннаті, Цинциннаті, штат Огайо

Цзіньчуань Сюе

9 Центр Вадсворта, Департамент охорони здоров’я штату Нью-Йорк, та Департамент наук про здоров’я навколишнього середовища, Школа громадського здоров’я, Державний університет Нью-Йорка в Олбані, Олбані, Нью-Йорк

Курунтахалам Каннан

10 Біохімічний факультет, Факультет природничих наук та експериментальної біохімії, Медичний дослідницький центр короля Фахда, Університет короля Абдулазіза, Джидда, Саудівська Аравія

Юет-Кін Леунг

7 Центр екологічної генетики, Медичний коледж Університету Цинциннаті, Цинциннаті, штат Огайо

11 Центр раку в Цинциннаті, Цинциннаті, штат Огайо

Майкл А. Томас

Шук-Мей Хо

6 Відділ екологічної генетики та молекулярної токсикології, Департамент екологічного здоров'я, Медичний коледж Університету Цинциннаті, Цинциннаті, штат Огайо

7 Центр екологічної генетики, Медичний коледж Університету Цинциннаті, Цинциннаті, штат Огайо

11 Центр раку в Цинциннаті, Цинциннаті, штат Огайо

12 Медичний центр лікарні для ветеранів Цинциннаті, Цинциннаті, штат Огайо

Анотація

ВСТУП

Безпліддя вражає одну з восьми пар у США, причому одна третина цих випадків не має відомих етіологічних причин [1]. Одним з винуватців є невдача імплантації, яка може становити 30% усіх втрат вагітності на ранніх термінах [2, 3]. Збільшується кількість доказів того, що фактори навколишнього середовища [4–6] та способу життя, такі як ендокринні руйнівники [7, 8] та дієта [9], впливають на імплантацію ембріонів і можуть суттєво сприяти безпліддям. Бісфенол А (BPA), прототип хімічної речовини, що руйнує ендокринну систему (EDC), є повсюдним у нашому середовищі, і 95% населення США має рівень сечі, який можна виявити [10]. Великі кількості синтезуються у виробництві пластикової тари для їжі та напоїв, водопровідних труб, валютних купюр та квитанцій з термопаперу [11–14]. Ненавмисне виділення з цих споживчих товарів забруднює нашу їжу, воду та тіла. Оскільки більш високий вміст BPA в сечі в діапазоні низьких доз (> 1,243 мкг/л) пов'язаний з множинними хронічними захворюваннями [15–20], його вплив на фертильність жінок з приводу ранньої втрати ембріонів викликає велике занепокоєння. Дійсно, у когорті жінок, які перенесли запліднення in vitro, більш високий рівень BPA в сечі (3,80–26,48 мкг/л) корелював із збільшенням відмови від імплантації [21].

Західна дієта, як правило, містить багато жиру. За даними Міністерства сільського господарства США, Служби сільськогосподарських досліджень, дієта вважається з високим вмістом жиру, якщо> 35% калорій припадає на жир, тоді як дієта з низьким вмістом жиру є такою, при якій 13 C12-BPA (≥99%) було придбано у Кембриджські ізотопні лабораторії. β-глюкуронідазу з Helix pomatia (197114 одиниць/мл β-глюкуронідази та 876 одиниць/мл сульфатази) було придбано у Sigma-Aldrich. Вихідні розчини цільових аналітів та внутрішні стандарти готували з концентрацією 1 мг/мл у метанолі та зберігали при -20 ° C.

Метанол (високоефективна рідинна хроматографія [ВЕРХ]) та етилацетат (марка ACS), використані в експериментах, були придбані у Mallinckrodt Baker. Вода Milli-Q очищалася ультрачистою водною системою (Barnstead International).

Підготовка зразка.

LC-ESI (-) MS/MS аналіз BPA.

Забезпечення якості/контроль якості.

Кількісну оцінку всіх аналітів проводили методом ізотопного розведення на основі відповідей 13 C12-BPA. Калібрувальні стандарти, що вводяться при різних концентраціях від 0,1 до 10 нг/мл, показали коефіцієнт регресії ≥0,99. Межі кількісного визначення (0,2 нг/мл) визначали, виходячи з найнижчої точки еталону калібрування та обсягу проби, взятої для аналізу, та коефіцієнта концентрації. В якості перевірки на інструментальний зсув факторів реакції, стандарт кожної калібрування вводили через кожні п’ять зразків. Для запобігання переносу цільових аналітів із зразка на зразок через кожні п’ять зразків вводили чистий розчинник (метанол).

Для вимірювання як вільного, так і загального вмісту BPA було проаналізовано п’ять процедурних заготовок для визначення концентрації, що походить від лабораторних матеріалів та розчинників. Середні рівні BPA, виявлені в процедурних заготовках, становили 0,20 та 0,26 нг/мл відповідно, і ці концентрації віднімали з виміряних значень зразків.

Виявлення ембріонів і культура

Ембріони перед імплантацією витягували з промивання яйцепроводу та матки 39 щурів GD4,5 (n = 6–9 щурів на групу) у середовищі М2 (Sigma) та культивували до утворення бластоцисти у 20 мкл крапель mR1ECM (Cosmo Bio) згідно з протоколом описана [37]. Порівнювали місце розташування, стадію розвитку та бластуляцію ембріонів з різних груп лікування.

Аналіз переростання бластоцисти

Аналіз переростання бластоцисти проводили, як описано раніше [38]. Коротше кажучи, зона пелюциди бластоцист щурів була розчинена в кислотному тироді (Sigma). Потім зародки, вільні від зони пелюціди, культивували на матриці фібронектину протягом 4 днів у модифікованому Дульбекко середовищі Eagle (Sigma), доповненому 10% плодовою бичачою сироваткою (Sigma). Зображення перерослих ембріонів знімали щодня за допомогою перевернутого мікроскопа (Carl Zeiss Microscopy GmH) із використанням об'єктива 20 × і аналізували за допомогою програмного забезпечення AxioVision Microscopy (Carl Zeiss). Площа, охоплена ембріоном, була записана як зона наросту. Виросли ембріони фіксували 4% параформальдегідом (об/об) (Sigma) та імуно забарвлювали для актинового цитоскелета, використовуючи мічені Alexa Fluor-488 антитіла проти F-актинів (Invitrogen). Флуоресцентні зображення були зроблені за допомогою конфокального мікроскопа LSM 710 (Carl Zeiss) з лазерними лініями 488 нм, 561 нм і 633 нм.

Оцінка розмірів ембріонів GD8

Репродуктивний тракт 17 щурів GD8 (n = 3–4 щури на групу) був зібраний та цифрово сфотографований для аналізів. Розмір ембріона, який називають периметром кожного місця імплантації, оцінювали для всіх ембріонів (загалом 215 ембріонів; 9–18 ембріонів на щура) за допомогою мікроскопа AxioVision та програмного забезпечення для аналізу Image J.

Гістологія та імуногістохімія

Тканини матки GD8 щурів фіксували у 10% формаліні, зневоднювали та вкладали у парафін. Серійні зрізи на 5 мкм фарбували гематоксиліном/еозином (Thermo Fisher Scientific) для гістологічного аналізу. Імуногістохімічний (IHC) аналіз проводили на зрізах, як описано раніше [39], щоб визначити експресію білка цитокератину-7 (CK7) та рецептора епідермального фактора росту (EGFR). У якості G-негативного контролю імуноглобуліну використовували звичайну сироватку крові (Vector Laboratories). Первинні антитіла до CK7 (Abcam) та EGFR (Abcam) розводили 1: 100 у блокувальному розчині. Вторинний козячий анти-кролячий IgG (Vector Laboratories) розводили 1: 200 в блокувальному розчині.

Статистичний аналіз

ТАБЛИЦЯ 1

Вплив впливу жирного жиру та вмісту BPA на рівень BPA у сироватці крові.