Високий дієтичний метіонін плюс холестерин стимулює ранній атеросклероз та пізній розвиток фіброзного ковпачка, що пов’язано зі зменшенням позитивних клітин бляшок GRP78

Анотація

Роль гомоцистеїну або його попередника метіоніну у формуванні фіброзних ковпачків та його асоціації зі стресом ендоплазматичного ретикулуму (ER) незрозуміла. Гомоцистеїн може стимулювати накопичення колагену та підвищувати регуляцію білка 78, регульованого глюкозою, що регулюється глюкозою, ER (GRP78). Метою цього дослідження було визначити, чи підвищений дієтичний метіонін збільшить волокнисті ковпачки, і що видалення атерогенної дієти зменшить кількість клітин, що зазнають стресу. Новозеландських білих кроликів годували атерогенною дієтою протягом 2, 4 або 12 тижнів [1% метіоніну + 0,5% холестерину (2MC, 4MC або 12MC)]; протягом 4 або 12 тижнів дієта на 0,5% холестерину (4Ch, 12Ch); та для вивчення регресії нальоту, дієта МС протягом 2 або 4 тижнів, що супроводжується 10 тижнями звичайної дієти (2MCr, 4MCr). Вивчали функцію ендотелію, атеросклероз та позитивні клітини GRP78. Функція ендотелію була скасована в 4MC, а атеросклероз збільшився в 17 разів (P 2 = 0,9). Ці дослідження показують, що високий дієтичний метіонін може бути корисним для стабілізації нальоту, а звичайна дієта також стабілізує наліт і зменшує кількість напружених клітин нальоту.

Роль дієтичного метіоніну у розвитку атеросклерозу незрозуміла. Троен та ін. показали, що надлишок дієтичного метіоніну може прискорити атеросклероз у нокаутованих мишей ApoE Troen et al. 2003, і ми раніше демонстрували подібні ефекти в моделі атеросклерозу кроликів після 12-тижневої дієти, що містить надлишок холестерину та метіоніну Zulli et al. 2003, 2004. Однак у клінічних умовах вплив високого плазмового гомоцистеїну на ССЗ залишається недійсним. Kaul et al. 2006. Клінічне випробування HOPE2 показало, що незначне зниження рівня гомоцистеїну не мало сприятливого впливу на клінічні результати, тоді як дослідження FIELD показало, що підвищений рівень гомоцистеїну був пов’язаний із зменшенням коронарних подій на 23%, але смертності не було. Це порушує питання щодо впливу гомоцистеїну на морфологію нальоту, оскільки гомоцистеїн може викликати окислювальний стрес, стимулює синтез колагену та проліферацію гладком’язових клітин Lentz 2005, фактори, що беруть участь у ремоделюванні бляшок.

Це дослідження було розроблено (а) для порівняння клітинної структури нальоту між високим вмістом холестерину в їжі і високим рівнем холестерину та метіоніном через 4 та 12 тижнів (b) для встановлення точної моделі для вивчення стабілізації атеросклеротичного нальоту протягом короткого періоду без хірургічного втручання втручання (c) для кількісної оцінки GRP78 позитивних клітин протягом цих періодів часу.

Методи

Дослідження ізометричної напруги

Черевні аорти розсікали на кільця розміром 6 × 3 мм і послідовно встановлювали між двома металевими гачками в органних ваннах, прикріплених до датчиків зміщення сили (Grass FT03), з'єднаних із системою збору даних (MacLab, ADInstruments, Bellavista, NSW, Австралія). Ванни наповнюють розчином Кребса, підтримують постійну температуру 37 ° C і постійно барботують 95% O2/5% CO2. Через 1 год посудини обережно розтягували до напруги у спокої 2 г. Ще через годину було встановлено максимальне звуження за допомогою високого розчину калієвих кребів (124 ммоль/л K +). Після плато (6 хв) судини промивали кріпами, а через 1 год кільця судин попередньо контрактували фенілефрином до приблизно 30–40% максимального скорочення. Після того, як скорочення стало стабільним, проводили криву реакції концентрації ацетилхоліну (10−8 –10 −6 моль/л Ах, половина логарифмічних одиниць) Zulli et al. 2003 рік.

Патологія стінки

Аналіз даних

Усі точки даних, проаналізовані anova, а потім багаторазове порівняльне тестування Ньюмана – Кельса після спеціального тесту або тесту Student’s, були відповідними. A P Рисунок 1м). Однак загальний рівень холестерину залишався підвищеним принаймні протягом 5 тижнів після початку дієти. Екстраполяційні криві додані до рисунка 1м. Тригліцериди крові не суттєво відрізнялися між групами.

Регресійна група

Після 10-тижневого режиму нормального харчування в бляшках черевної аорти спостерігаються товсті фіброзні ковпачки як у 2Wr (рис. 2г), так і в 4Wr (рис. 1j і 2f, h, i, k, l) та в лівій магістральній коронарній артерії (рис. 1k ). Дійсно, волокнисті ковпачки становили 46% (Р Малюнок 2м), а вміст макрофагів нальоту зменшився на 60% (Р Малюнок 1l). Це було пов’язано із помітним падінням позитивних клітин GRP78 над атеросклеротичними бляшками порівняно з усіма іншими групами (малюнки 2c, e, g, b порівняно з d, f та кількісно виражені в m). Важливо зазначити, що кількість бляшок у групах 4MC та 4MCr не суттєво відрізнялося (Малюнок 1n); однак відбулися суттєві зміни в біологічній структурі нальоту, що свідчить про більш стабільний фенотип нальоту (малюнки 1l та and2m 2m).

Щоб показати колагенову та клітинну природу ковпачка, було проведено трихромове фарбування, а також імунореакцію VSMC (гладком’язових клітин судин). Колаген (синій) можна чітко спостерігати над клітинним ядром (червоний) і показаний на малюнку 1i, а VSMC були помітними по всій бляшці (рис. 2j) порівняно з макрофагами (рис. 1j, 2k). Серійні зрізи (малюнок 2j, l) чітко показують позитивні клітини RAM11, які реагують з антитілом GRP78. Крім того, для підтвердження зменшення стресу ER, другий маркер CHOP також був мінімально присутній у 4Wr.

Клітини GRP78 у фіброзному ковпаку

Далі ми прагнули визначити кількість позитивних клітин GRP78 у фіброзному ковпачку. Ми виявили, що у чотирьох групах з очевидним утворенням фіброзного ковпачка в атеросклеротичних бляшках існувала зворотна залежність між розміром фіброзного ковпачка та позитивними клітинами GRP78 (r 2 = 0,9, малюнок 2n).

Ендотеліальна функція

Обговорення

Основними висновками цього дослідження є (а) атеросклеротичні бляшки кроликів в черевній аорті та лівій магістральній коронарній артерії можуть стабілізуватися (товсті волокнисті капелюшки, низький вміст макрофагів) через 10 тижнів після 4-тижневої атерогенної дієти метіонін та холестерин посилюють формування атеросклерозу протягом 4 тижнів порівняно з високим рівнем холестерину, що дієтично, але додавання дієтичного метіоніну до дієти з високим рівнем холестерину протягом 12 тижнів спричиняє товстіші волокнисті ковпачки порівняно з холестерином (c) у черевній порожнині відмінена функція ендотелію аорта кроликів, яких годують високим рівнем холестерину та метіоніну через 4 тижні, що не повертається до норми через 10 тижнів нормального харчування (d) Позитивні клітини GRP78 у бляшках знижуються під час регресії.

Модель кролика широко застосовується для вивчення стабілізації атеросклеротичного нальоту. Наприклад, сучасні дослідження включають використання фототочкової фотодинамічної терапії, яка, як було показано, сприяє стабілізації атеросклеротичних бляшок кроликів та пригнічує прогресування нальоту Waksman et al. 2008; втручання фенофібрату для поліпшення стабільності нальоту Jeanpierre et al. 2008, а також генетична гіперліпідемічна модель (WHHL (Watanabe heritable hyperlipidemic) кролик) для вивчення впливу статинів на індекс вразливості бляшок (стабільний фенотип нальоту) Shiomi et al. 2001. У цих моделях і представленій тут моделі ми повинні підкреслити, що ці бляшки не нагадують атеросклероз коронарних артерій IV типу у людини Stary 2000; Старі та ін. 1995, 1994. Однак ми припускаємо, що цю модель кролика можна використовувати для вивчення факторів, які можуть впливати на клітинну біологію нальоту, що нагадує більш стабільний фенотип нальоту (індекс вразливості нальоту) без необхідності хірургічного втручання.

У цьому дослідженні ми спостерігали, що рівень холестерину в плазмі крові залишався підвищеним протягом 4 тижнів після початкового режиму дієти протягом 2 тижнів або 4 тижнів. Це чітко демонструє порушення кліренсу холестерину у кролячої моделі і підтверджується іншими дослідженнями, які показують, що рівень холестерину в плазмі крові не нормалізується за короткий проміжок часу Balkan et al. 2004; Феннессі та ін. 1994. Ці результати суттєво контрастують з іншими, які показали 4-тижневу нормальну дієту після 4-тижневої дієти з високим рівнем холестерину, повністю відновлену плазмовий рівень холестерину Van Winkle & Levy 1970; Охара та ін. 1995. Хоча це можна пояснити різницею у вмісті жирів у дієтах, дієта з високим вмістом жиру, високим рівнем холестерину та високим вмістом метіоніну може бути більш фізіологічно важливою дієтою, ніж годування лише високим рівнем холестерину.

На закінчення ми показуємо, що лише за 4 тижні дієтичних маніпуляцій у кроликів спостерігається відмінена функція ендотелію та важкий атеросклероз, і що 10 тижнів нормальної дієти після початкової 4-тижневої атерогенної дієти відновлює нормальний ліпідний профіль, ініціює відновлення функції ендотелію і призводить до більш стабільного фенотипу атеросклеротичного нальоту (товста фіброзна шапка/низький вміст макрофагів) та зменшення клітин, що зазнають стресу в ER. Ми також показуємо, що комбінація високого дієтичного метіоніну та холестерину протягом 12 тижнів викликає більш стабільний фенотип нальоту, що свідчить про те, що метіонін може бути важливим стабілізатором нальоту. Наші результати проливають світло на вплив метіоніну на атерогенез та можливість використання інгібіторів стресу ER у кролячої моделі атеросклерозу.