Суміш амінокислот послаблює порушення глікемії, але не впливає на розвиток ожиріння у щурів, що харчуються дієтою, що містить AGE

Yi-Hung Liao 1, Chung-Yu Chen 2 *, Chiao-Nan Chen 3 *, Chia-Ying Wu 1, Shiow-Chwen Tsai 4

1. Департамент фізичних вправ та наук про здоров'я, Національний університет медсестер та наук про здоров'я в Тайбеї, Тайбей 11219, Тайвань;
2. Департамент фізичних вправ та наук про здоров'я, Тайбейський університет, Тайбей 11153, Тайвань;
3. Кафедра фізичної терапії та допоміжних технологій Школи біомедичних наук та техніки Національного університету Ян-Мін, Тайбей, 112, Тайвань;
4. Інститут спортивних наук, Тайбейський університет, Тайбей 11153, Тайвань.
* Чень, C.-Y. та Чен, C.-N. внесли однаковий внесок у цю роботу.

Цитування:
Ляо YH, Чень CY, Chen CN, Wu CY, Tsai SC. Суміш амінокислот послаблює порушення глікемії, але не впливає на розвиток ожиріння у щурів, що харчуються дієтою, що містить AGE. Int J Med Sci 2018 рік; 15 (2): 176-187. doi: 10.7150/ijms.22008. Доступно з https://www.medsci.org/v15p0176.htm

Передумови: Нездорові західні дієтичні схеми призводять до надмірного споживання жиру та кінцевих продуктів гликозирования (AGEs), і це пояснює розвиток ожиріння, діабету та пов’язаних з цим метаболічних порушень. Нещодавно було продемонстровано, що деякі амінокислоти (АА) покращують глікемію та зменшують ожиріння. Отже, нашими основними цілями було вивчити, чи може годування збагаченою ізолейцином сумішшю АА (4,5% АА; Іль: 3,0%, Лей: 1,0%, Вал: 0,2%, Арг: 0,3% у питній воді) впливати на розвиток ожиріння та запобігання порушенню рівня глікемічного контролю у щурів, яких годували жиром/AGE-вмісною дієтою (FAD).

Методи: Двадцять чотири самці щурів Спраг-Доулі були призначені на 1) контрольну дієту (CD, N = 8), 2) дієту FAD (FAD, N = 8) та 3) дієту FAD плюс АА (FAD/AA, N = 8 ). Після 9-тижневого втручання оцінювали здатність глікемічного контролю (рівень глюкози, ITT та рівні HbA1c), склад тіла та спонтанну опорно-рухову активність (SLA), а також проводили збір проб крові натще для аналізу метаболічних гормонів (інсулін, лептин, адипонектин та кортикостерон). Жирові тканини також збирали хірургічним шляхом і зважували.

Результати: Щури FAD продемонстрували значне збільшення приросту ваги,% жиру в організмі, рівня глюкози в крові, HbA1c, лептину та площі під кривою глюкози під час тесту на толерантність до інсуліну (ITT-глюкоза-AUC) порівняно з щурами CD. Однак рівні глюкози в крові, HbA1c, лептину та AUC ITT-глюкози натще не відрізнялись між щурами CD та FAD/AA. Щури FAD/AA також продемонстрували більший приріст тестостерону в сироватці крові.

Висновок: Суміш амінокислот, що складається з Ile, Leu, Val та Arg, показала явні захисні переваги щодо запобігання ожирінню, викликаному FAD, та порушення глікемічного контролю.

Ключові слова: Вісцеральний жир, рухова активність, чутливість до інсуліну, лептин, тестостерон, HbA1c.

Маючи це на увазі, ми припустили, що додавання нової суміші гіпоглікемічних амінокислот (Leu, Ile, валін та Arg) може принести користь для поліпшення системного контролю глікемії та зниження ваги при дієті, що містить жир/AGEs (FAD) індуковані ожирінням щури. Отже, метою цього дослідження було визначити, чи надання нової амінокислотної суміші, що містить лейцин, ізолейцин, валін та аргінін, може покращити розвиток ожиріння, спричиненого дієтою, та метаболічних розладів у щурів Спраг-Доулі, яких годували дієта, збагачена жирами/ВІК.

Догляд та утримання тварин

Двадцять чотири самці щурів Sprague-Dawley (7 тижнів) були придбані у компанії Lasco Biotechnology Company (місто Тайбей, Тайвань). По прибутті щурів потім розміщували індивідуально в приміщенні для тварин з контролем температури та вологості з штучним циклом 12-12 годин темно/світло (температура 22-24 ° C; відносна вологість 35-45%). У перший тиждень аклімації всі щури отримували стандартну лабораторну чау (LabDiet® 5LL2; PMI Харчування International, Сент-Луїс, Міссурі, США) та вод ad libitum, і їх дієти потім були змінені на стандартну дієту чау або на дієту з високим вмістом жиру/високим віком (FAD) відповідно до експериментальної конструкції. До проведення експерименту всі процедури догляду за тваринами були затверджені та дотримувались вказівок Інституційного комітету з догляду та використання тварин (IACUC) при Тайбейському університеті (номер затвердження IACUC: UT104002).

Експериментальний дизайн

Розрахункове споживання АА для щурів з добавкою амінокислотної суміші

Суміш амінокислот Кількість споживання амінокислот (мг/кг/добу)

Доза (% у питній воді)	0 тиждень	3 тижні	6 тиждень	9 тиждень
Амінокислоти (4,5% AA)	Не застосовується	3375 ± 425	2706 ± 249	2445 ± 276
Ізолейцин (Іль: 3,0%)	Не застосовується	2250 ± 283	1804 ± 166	1630 ± 184
Лейцин (лей: 1,0%)	Не застосовується	750 ± 94	601 ± 55	543 ± 61
Валін (Вал: 0,2%)	Не застосовується	150 ± 19	120 ± 11	109 ± 12
Аргінін (Арг: 0,3%)	Не застосовується	225 ± 28	180 ± 17	163 ± 18

Розрахована кількість споживання амінокислот (мг/кг/добу) розраховували відповідно до кількості щоденного споживання води щурами з добавкою амінокислотної суміші (група FAD/AA; n = 8). Суміш амінокислот, що складається з Іле (3,0%), Леу (1,0%), Валу (0,2%) та Arg (0,3%), розчинили у питній воді та подали тваринам ad labium, і розчин готували щодня у свіжому вигляді для забезпечення якості добавки. Не застосовується: Не застосовується (За тиждень 0 не було подано амінокислотної суміші). Значення виражаються як Середнє значення ± S.E.М.

експериментальна процедура

Після 8 тижнів дієтичного втручання ми використовували метод подвійної енергії рентгенівської абсорбціометрії (DEXA) для визначення складу тіла тварини, а також проводили тест на толерантність до інсуліну (ITT) для оцінки їх системної чутливості до інсуліну. По закінченні 9-тижневого лікування щури голодували протягом 12 годин, а на ніч збирали зразки крові з хвоста (0,5 мл). Після цього зразки цільної крові збирали в пробірку, що містить 50 мкл ЕДТА (24 мг/мл, рН 7,4), і негайно використовували для вимірювання рівня глюкози в крові за допомогою портативного аналізатора глюкози в крові (One Touch Ultra 2; LifeScan Inc., Milpitas, CA). Решту крові центрифугували при 3000 × g протягом 10 хв при 4 ° C за допомогою центрифуги Eppendorf ™ Model 5810 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), а плазму аликвотували і зберігали при -80 ° C до аналізу для подальших біохімічних аналізів. Після швидкого забору проби крові щурів евтаназували внутрішньочеревною ін’єкцією пентобарбіталу натрію (40 мг/кг), а вісцеральні жирові тканини (частини заочеревинного відділу та придатків яєчка) хірургічно збирали та зважували за допомогою електронного мікромасштабу.

Підготовка до дієти з високим вмістом жиру/ВІК (FAD)

Стандартна комерційна дієта з високим вмістом жиру (HFD: PRO 20%, CHO 35%, FAT 45%, загальна кількість 4,73 ккал/г; D12451, дослідна дієта) була обрана для підготовки до дієти на гризунах з високим вмістом жиру/AGE це дослідження. Дієта на гризунах з високим вмістом жиру/AGE (FAD) була підготовлена відповідно до попереднього дослідження Feng et al. [8]. Коротше кажучи, дієта для гризунів з високим вмістом жиру була піддана тепловому циклу (180 ° C протягом 45 хв) і збагачена добавкою для компенсації виснажених мікроелементів, що виснажуються. Більше того, для забезпечення якості дієти цей FAD готували з триденним інтервалом і зберігали в холодильнику при температурі 4 ° C перед тим, як виносити його на годівлю. Рівень AGE у зразках раціону для гризунів (CD та FAD) вимірювали шляхом визначення кількості вмісту AGE у раціоні гризунів методом флюороспектрометрії [26]. У цьому дослідженні вміст AGE у приготовленій дієті з високим вмістом жиру/AGEs був приблизним

В 3,41 рази більше, ніж у стандартній дієті для гризунів (FAD: 5,59 нг/г білка проти CD: 1,64 нг/г білка; FAD міститься

341% вікових груп вище рівня CD).

Аналіз складу тіла щурів та маси тканин

Після 8 тижнів лікування ми вимірювали склад тіла щурів, використовуючи метод подвійної енергії рентгенівської абсорбціометрії (DEXA), як описано раніше [27, 28]. Коротше кажучи, перед вимірюванням DEXA прилад DEXA (Lunar PIXImus, GE Lunar, Madison, WI, USA) калібрували за допомогою східчастої планки з акриловими пластиковими та алюмінієвими секціями, що імітують м'які тканини та кістки відповідно до робочих інструкцій виробника відповідно . Після цього всіх щурів знеболювали шляхом внутрішньочеревної ін’єкції пентобарбіталу натрію (40 мг/кг), а потім їх поміщали в лежаче положення на платформі щурів у всіх скануваннях DEXA. Життєві ознаки тварин постійно контролювались зором під час сканування DEXA, а потім їх поміщали в клітини з інтенсивним моніторингом життєвих показників до пробудження. Результати сканування аналізували за допомогою програмного забезпечення, що надається виробником, а відсоток жиру в організмі та відсоток нежирної маси реєстрували в електронній таблиці. Коли дієтичне втручання закінчилося, щурів евтаназували внутрішньочеревною ін’єкцією пентобарбіталу натрію (40 мг/кг), а внутрішньочеревні вісцеральні жирові тканини (заочеревинний та придатковий придатки) були хірургічно видалені та зважені за допомогою електронного мікромасштабу.

Вимірювання рівня глюкози в крові та HbA1c

На завершення 9-тижневого дієтичного втручання зразок крові натще (0,5 мл) відбирали у пробірку, що містить 40 мкл ЕДТА (24 мг/мл, рН 7,4), а потім використовували для вимірювання глюкози в крові та гемоглобіну А1с (HbA1c). Концентрацію глюкози в крові вимірювали за допомогою портативного аналізатора глюкози з тест-смужкою на основі глюкозидегідрогенази (GD) та глюкозооксидази (GO) (One Touch Ultra 2; LifeScan Inc., Milpitas, CA, USA). Рівень HbA1c у крові визначали за допомогою біохімічного аналізатора HbA1c з тест-смужкою імунної реакції HbA1c (Eclipse A1c Analyzer, ApexBio Inc., Тайбей, Тайвань). Крім того, аналізатор глюкози та аналізатор HbA1c калібрували перед кожним експериментом згідно з інструкціями виробника.

Тест на толерантність до інсуліну (ITT)

Тест на толерантність до інсуліну проводили за три дні до завершення 9-тижневого дієтичного втручання, і протокол ІТТ проводився, як описано раніше [29]. Для ІТТ, після нічного голодування (10 годин), щурам внутрішньочеревно вводили 0,75 U людського інсуліну/кг маси тіла (звичайний Humulin, Eli Lilly, Indianapolis, IN, USA). Зразки крові на хвості збирали перед ін'єкцією інсуліну (0 хв) та через 30 та 60 хв. Аналогічно, концентрацію глюкози в крові під час ІТТ вимірювали за допомогою портативного аналізатора глюкози, як було описано раніше (One Touch Ultra 2; LifeScan Inc., Мілпітас, Каліфорнія, США), і розраховували площу під кривою (AUC) реакції глюкози в крові під час ІТТ використовуючи правило трапеції.

Оцінка рівня спонтанної рухової активності

Рівні спонтанної рухової активності (SLA) тварин вимірювали на 8-му тижні лікування, використовуючи систему аналізу відеоспостереження для рухового руху тварин, згідно з попереднім звітом [30]. Коротше кажучи, ми перевірили рівень рухової активності тварин під час їх темного циклу в 2100 годин завдяки нічній поведінці щурів. Для вимірювання рівня активності щурів поміщали індивідуально у відкриту коробку з чорного пластику (довжина: 50 см; ширина: 50 см; і висота: 50 см), і це вимірювання проводили в ізольованому темному запису приміщення без будь-яких зовнішніх порушень для забезпечення точності. Рівень SLA щурів протягом 10-хвилинного перебування відстежували та аналізували за допомогою програмного забезпечення LocoScan (LocoScan, CleverSys Inc., VA, USA) відповідно до інструкцій виробника.

Вимірювання рівня гормонального рівня, пов’язаного з метаболізмом у сироватці крові

Наприкінці втручання зразки крові натощак на хвості щура збирали в пробірки, а потім центрифугували при 3000 × g протягом 10 хвилин, а супернатанти зберігали і використовували для подальших гормональних аналізів. Супернатант використовували для вимірювання інсуліну щурів (CV-аналіз внутрішньо аналізу = 3,7%, Mercodia Ультрачутливий щурячий інсулін ELISA, Mercodia AB, Упсал, Швеція), лептин щурів (CV-тест внутрішнього аналізу = 1,9%, BioVendor, Чехія Республіка), адипонектин щурів (CV% = 4,4%, AssayMax TM, Assaypro LLC, Сент-Чарльз, Міссурі, США), кортикостерон щурів (CV% = 7,4%, Immuno-Biological Laboratories Inc., IBL-America, Міннеаполіс, Міннесота, США) та тестостерон (CV-аналіз внутрішньо аналізу = 8,8%, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) за допомогою комерційних доступних наборів імуноферментних аналізів (ІФА) відповідно до виробників інструкції. Після завершення кожного аналізу оптичну щільність та гормональну концентрацію зразків вимірювали та обчислювали за допомогою системи виявлення зчитувача ELISA (Tecan GENios Microplate Reader, Швейцарія).

Статистичний аналіз

Усі дані були представлені як середнє значення ± стандартна помилка середнього значення (Середнє значення ± S.E.M.). Періодичний темп росту обчислювали з інтервалом у 3 тижні для вимірювання приросту маси тіла кожні 3 тижні. Дані в цьому дослідженні були проаналізовані та відображені за допомогою програмного забезпечення SPSS 20.0 (статистика IBM SPSS для Windows, Нью-Йорк, США) та GraphPad Prism 5.0 (GraphPad software Inc., La Jolla, CA, USA), відповідно. Перш ніж проводити статистичний аналіз, ми використовували тест нормальності Шапіро-Вілка для аналізу нормальності всіх змінних. Двосторонній дисперсійний аналіз (ANOVA) з повторним вимірюванням з подальшим останньою значущою різницею (LSD) пост-hoc використовували для порівняння змін маси тіла, споживання енергії з їжею та реакції глюкози під час ІТТ з часом. Один із способів ANOVA з подальшим LSD пост-hoc був використаний для порівняння відмінностей у складі тіла (маса без жиру, відсоток жиру в тілі та маса вісцерального жиру), біомаркерах здатності контролю глікемії (глюкоза в крові, інсулін та HbA1c) та циркулюючі гормональні концентрації (інсулін, лептин, адипонектин, кортикостерон та тестостерон) одночасно в експериментальних групах. Для оцінки кореляції між гормонами застосовували тест коефіцієнта кореляції Пірсона. Рівень альфа був встановлений на 0,05 (стор

Надійшла до 2017-7-20
Прийнято 18.11.2017
Опубліковано 2018-1-1