Співвідношення між структурами спільноти тибетців мікробіоти кишечника та географією

Предмети

Авторська виправлення до цієї статті було опубліковано 19 березня 2018 року

Ця стаття оновлена

Анотація

Вступ

Тибетське плато вважається третім полюсом і є одним із місць на землі з найекстремальнішими умовами життя 1. Це місце характеризується низьким рівнем кисню, високою радіацією та нестачею запасів 1,2. Ці умови є грізними фізіологічними проблемами для людей або тварин, що мешкають на цьому високогірному плато 3. Однак корінне населення Тибету займало суворі місця понад 25 000 років і створило велику цивілізацію в Гімалаях та інших регіонах 4,5,6. Ці тибетці служать хорошим прикладом успішної адаптації на висоті 3. Тибетці також є хорошими прикладами для вивчення механізмів висотної адаптації. Були проведені численні роботи з виявлення молекулярних сигнатур адаптації на висоті у широкому діапазоні географічних розташувань за допомогою загальногеномних аналізів 3,7,8,9,10. Тибетці також виробили унікальний спосіб життя та дієтичні звички, наприклад, м'ясо (яловичина та баранина), масло як, молоко та інші молочні продукти є основними харчовими продуктами, але споживається мінімум овочів та фруктів 11 .

Генетичні відмінності були виявлені загальногеномним аналізом або іншими молекулярними методами між тибетцями та ханьцями 3,7,8,9,10. Деякі дослідження порівнювали фекальні мікробіоти між тибетськими та ханськими популяціями та монголами, припускаючи різні структури мікробіомів кишок у тибетців 2,19,20. Порівняно з популяціями хана, тибетський мікробіом характеризувався відносною чисельністю Превотелла, тоді як стілець Хан був збагачений Бактероїди 23. Тибетці, що мешкають на великих висотах (4800 м), показали мікрофлору, збагачену бактеріями, що продукують бутират, у відповідь на суворі умови 23. Коротколанцюгові жирні кислоти (SCFA), вироблені Клострідій, Десульфовібріо, Бактероїди, Лактобактерії, і Превотелла може допомогти у зниженні артеріального тиску та адаптації до енергетичних потреб та легеневої гіпертензії 2,23. Однак не надходило повідомлень про широкомасштабне розкриття фекальної мікробіоти тибетців (Тибетське плато вимірює приблизно 2 500 000 км 2). Різні географічні розташування, спосіб життя, способи ведення ферми та частота спілкування з іншими місцями можуть відрізнятися залежно від мікробіома кишечника тибетців.

У цьому дослідженні, щоб визначити кореляцію між структурами мікробіоти кишечника тибетців та географією, ми проаналізували мікробіоти фекалій з 208 зразків із шести регіонів з висотами від 2800 м до 4500 м по Тибетському плато і порівняли філогенетичне різноманіття та таксономічну відносну чисельність серед них регіонах.

Результати

Секвенування та фільтрація ДНК

Всього з платформи MiSeq було сформовано 17 870 011 необроблених зчитувань. Після фільтрування низькоякісних зчитувань було збережено 16 509 385 чистих зчитувань довжиною 240-300 п.н., і майже 7,04% необроблених даних було відфільтровано. Середня кількість високоякісних зчитувань у кожному зразку сягала 79 372 і коливалась від 12 594 до 125 895 у всіх зразках.

Мікробна різноманітність у зразках з різних місць на Тибетському плато

Усі 16 509 385 високоякісних послідовностей були згруповані в оперативні таксономічні одиниці (OTU) на 97% схожості послідовностей за допомогою програмного забезпечення Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME). Загалом було виявлено 1544 OTU (таблиця S1). Криві розрідження показали, що рівень плато досягнутий у всіх зразках (Рисунок S1) із значенням покриття Гуда в діапазоні від 98,94% до 99,84%, виявляючи, що наша глибина секвенування була достатньою для видобутку мікробної спільноти у фекальних зразках. Мікробна різноманітність (індекс Шеннона) та багатство (індекс Чао) показали значні відмінності між зразками в різних місцях (рис. 1). Індекс Шеннона був найвищим у зразках Хонгюань (HY), Лхаса (LS) та Nagqu (NQ), тоді як індекс Чао був найвищим у зразках Ганча (GC), HY, LS та NQ. Найнижчий індекс Чао становив 187 у Тяньчжу (TZ), тоді як найнижчий індекс Шеннона досяг 2,44 у Ганнані (GN).

Мікробна різноманітність та багатство зразків. (A-C.) Індекс Чао. (A) Різні місця, (B) Висота над рівнем моря, (C.) Віки; (D – F) Індекс Шеннона. (D) Різні місця, (Е) Висота над рівнем моря, (F) Віки. Маленькі букви "abcd" над стовпчиками представляють різницю між групами, одна і та ж буква вказує на те, що різниця несуттєва, тоді як буква різниці вказує на значну різницю.

Висота розташування GN і TZ вимірювалася нижче 3000 м, тоді як місце розташування LS, HY та GC становило від 3000 до 4000 м. NQ був найсуворішим місцем із середньою висотою понад 4000 м. Разом із зростанням висоти, бактеріальне різноманіття в кишечнику збільшилося з 2,80 в GN і TZ до 4,27 в NQ, тоді як багатство в кишечнику зросло з 212 до 301.

Бактеріальне різноманіття та багатство також корелювали з віком. На старій стадії бактеріальне різноманіття та багатство були найвищими, досягнувши 3,82 та 309 відповідно. Бактеріальне різноманіття та багатство збільшувались із ростом людей. Однак не існує кореляції між мікробіомами кишечника та ІМТ (дані не наведені).

Бета-різноманітність мікробіоти кишечника серед різних місць на Тибетському плато

Порівняння проводили для виявлення відмінностей між зразками з різних місць. Аналіз основних компонентів (PCA) та кластерний аналіз свідчать про те, що спостерігались суттєві відмінності між зразками з різних місць (p Рисунок 2

Аналізи PCA для виявлення подібності між різними зразками. (A) Різні місця, (B) Висота над рівнем моря, (C.) ІМТ, (D) Віки.

Склад бактерій у кишках тибетців суттєво змінювався із збільшенням висоти (рис. 2Б). Що стосується ІМТ, лише учасники з низькою вагою мали різні бактеріальні профілі порівняно з учасниками із нормальною вагою та ожирінням. Однак відмінностей серед інших учасників не спостерігалося (рис. 2С). За процесів росту бактеріальні спільноти значно змінювались на етапах розвитку дітей та молоді; і старих та молодих (рис. 2D).

Бактеріальні склади кишок тибетців у різних місцях

Майже всі послідовності (99,99%) у наборі даних були присвоєні бактеріальному царству, але кілька зчитувань залишились некласифікованими. Загалом із зразків було виявлено 18 бактеріальних видів; Сюди входили бактероїдети (60,00%), фірмікути (29,04%), протеобактерії (5,40%) та актинобактерії (3,85%) (рис. S2), що становило 90% від загальної кількості послідовностей. Однак частка однакових бактерій у зразках з різних регіонів була різною на рівні типу. Відносна кількість бактероїдетів у ВН (82,27%) була найвищою серед усіх груп, за якими йшли HY (66,99%), ТЗ (54,48%), LS (59,12%), NQ (51,10%) та ГК (45,90%). Міцність у зразках NQ (40,00%) та GC (41,49%) була більшою, ніж у зразках HY, LS, TZ та GN. Відносна чисельність твердих речовин у зразках GN досягла 11,71%, що набагато нижче, ніж у інших зразках, особливо в зразках GN. Актинобактерії у зразках NQ (3,85%) були набагато нижчими, ніж у інших зразках. Співвідношення F/B у всіх зразках становило 0,48. Співвідношення F/B становило 0,14, 0,37, 0,46, 0,58, 0,78 та 0,90 у популяціях GN, HY, LS, TZ, NQ та GC відповідно.

На рівні класів у всіх зразках було виявлено 34 класи (рис. S3), з яких 91,20% були представлені бактеріями, що належать до класів Bacteroidia, Clostridia, Gammaproteobacteria та Actinobacteria. Статистика показала, що 25 класів суттєво різнились у всіх зразках (стор Таблиця 1 Базові бактеріальні композиції у всіх зразках кишечника.

Рисунок 3 ілюструє загальні OTU, якими розподіляються місця розташування GC, GN, HY, LS, NQ і TZ, із загальною кількістю виявлених 594 OTU. Ці 594 OTU були присвоєні 53 різним сім'ям, а кількість OTU, що належать Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Prevotellaceae та Bacteroidaceae, становила 182, 115, 66 і 28 відповідно. Найбільш розповсюдженою родиною були Prevotellaceae, які представляли 42,86% від загальної кількості послідовностей. Рясність Ruminococcaceae (13,60%) та Bacteroidaceae (11,62%) була вище, ніж 10% від загальної кількості послідовностей.

VENN аналізує різні локації.

Мікробні підписи в різних зразках

Аналіз VENN показав, що деякі OTU є унікальними для деяких місцевостей, наприклад, 909 OTU в TZ, 1157 у NQ, 1034 у HY, 1002 у GC, 1031 у GN та 1239 у LS (рис. 3)

Далі проводили лінійний дискримінантний ефект ефекту аналізу (LEfSe) для виявлення мікробної сигнатури в кожному місці. Фірмова мікробіота кишечника включала Prevotellaceae, Bacteroidales та Veillonellaceae у зразку GN; Bacteroidaceae, Staphylococcaceae, Lachnospiraceae та Clostridiales у зразку ГХ; Micrococcaceae у зразку LS; Rikenellaceae у зразку HY; Porphyromonadaceae, Ruminococcaceae та Erysipelotrichaceae у зразку NQ; Prevotellaceae у зразку TZ; Sphingobacteriaceae, Elusimicrobiaceae та Rhizobiales у LSsample; і Clostridiaceae у зразку ГХ (рис. 4А).

LEfSe проводили на основі бактеріального співтовариства у всіх зразках. (A) Різні місця, (B) Висота над рівнем моря, (C.) MBI, (D) Віки.

Methanobactericeae, Coriobacteriaceae, Prevotellaceae, Bacteroidales та Veilonellaceae були характерною мікробіотою в кишках учасників, що мешкали в середовищі нижче 3000 метрів. Actinomycetales, Porphyromonadaceae та Clostridiales були мікробною мікробою в зразках з місць розташування між 3000 і 4000 м (рис. 4B). Bacteroidaceae, Enterobacteriaceae та Verrucomicrobiae були характерною мікробіотою в кишках учасників ожиріння (рис. 4С). Тільки літні люди подавали унікальні бактеріальні податки, що належать до Lactobacillales та Enterobacteriales (рис. 4D).

Кореляція між мікробіомом кишечника та віком, висотою та індексом маси тіла (ІМТ)

Співвідношення між бактеріальною спільнотою та місцезнаходженнями, віком, висотою та ІМТ визначали, використовуючи мікробний склад на рівні роду (> 1%). Результати канонічного аналізу відповідності (CCA) показали, що різні податки в кишках впливали на вік, висоту та ІМТ. Румінококкові, Prevotella та Lachnospiraseae були основними негативними з висотою. Faecalibacterium, Bacteroides та Bifidobacterium були позитивними з висотою, ІМТ та віком (рис. 5).

CCA - вік, висота над рівнем моря, ІМТ та місце розташування із складом спільноти на рівні роду.

Аналіз типів держав-співтовариств

Аналіз КНТ показав, що чотири КНТ присутні у тибетців, а саме, Бактероїди, Превотелла, Ruminococcaceae і Сукчінівібріо (Рис. 6). Превотелла КНТ, який був присутній у 124 з 208 учасників, був найпоширенішим, а потім - Бактероїди і Ruminococcaceae КНТ. Крім того, четвертий КНТ, який належав Росії Сукчінівібріо, було виявлено у двох зразках з LS, одному зразку з GN та одному зразку з HY (Таблиця 2).

Теплова карта повного зв’язку кластеризації зразків на основі родового складу та чисельності у спільнотах.

Обговорення

Дослідження мікробіоти кишечника тибетців з шести місць було проведено за допомогою платформи секвенування MiSeq. Результати показали, що бактеріальний склад у кишках тибетців суттєво змінювався із збільшенням висоти, ІМТ та віку. Основна мікробіота включена Превотелла, Фекалібактерії, і Блаутія. У всіх зразках було виявлено чотири КНТ.

Географічне розташування приймаючої сторони, спосіб життя, дієта та вік відіграють важливу роль у формуванні структури мікробних спільнот кишечника на основі опитувань населення США, Європи та Кореї 15,24. Структура бактеріальних спільнот у тибетців корелювала із згаданими вище факторами. Однак різноманітність та багатство бактерій не суттєво корелювали з ІМТ. Основна мікробіота міститься Превотелла, Фекалібактерії, і Блаутія у тибетців. Превотелла був домінуючим родом; цей результат узгоджується з результатами інших досліджень. Три роди були загальними для основних ОТУ у китайських та західних популяціях 2. Попередні дослідження на функціональному та метаболічному рівнях показали, що ці роди відіграють ключову роль у синтезі основних метаболітів у шлунково-кишковому тракті людини. Отже, основна мікробіота кишечника у всіх людей може коливатися в обмежених межах.

На закінчення це дослідження показало, що тибетці, які живуть на великих висотах, виявляються з низьким співвідношенням F/B. Значні відмінності мікробіоти кишечника спостерігались між різними місцями розташування, висотами та віком. Було виявлено чотири КНТ. Мікробіота кишечника відіграє важливу роль у регулюванні висотної адаптації та дієти з високим вмістом жиру.

Матеріал та методи

Місце дослідження та відбір проб

У цьому дослідженні 208 здорових тибетських добровольців було набрано для відбору проб, які охопили шість місць на Тибетському плато; райони включали GC (30 зразків), GN (52 зразки), HY (29 зразків), LS (32 зразки), NQ (34 зразки) і TZ (30 зразків) (рис. 7). Вік учасників коливався від 0,7 до 86 років. Вони були згруповані в різні вікові категорії: немовля (1–4 роки), діти (5–12 років), неповнолітні (13–18 років), юнаки (19–39 років), середні (40– 59 років) та старих (старше 60 років). Для розрахунку ІМТ були доступні зріст і вага (таблиця S2). ІМТ класифікували на чотири, а саме на недостатню вагу (ІМТ, Рисунок 7

Карта місць відбору проб. Сайти вибірок відображаються за допомогою програмного забезпечення MapGIS 10.2 Desktop (http://www.mapgis.com/index.php/index-view-aid-977.html, китайське програмне забезпечення).

Усі добровольці, набрані в рамках цього дослідження, були корінними жителями і проживали в одному населеному пункті принаймні три покоління, не одружуючись з особами будь-якої іншої етнічної групи, і ніколи не виїжджали з Тибету. Ці люди не відчували захворювань кишечника або метаболізму, а також не приймали жодних антибіотиків або пробіотиків протягом трьох місяців до дати відбору проб. У таблиці S2 наведено детальну інформацію, наприклад, вік, стать та підйом. Відбір проб проводився згідно з методами, опублікованими раніше 2. Зразки калу витримували в рідкому азоті відразу після збору і зберігали при -80 ° C перед подальшими експериментами. Це дослідження було схвалено Комітетом з етики Південно-Західного університету для національностей, і перед тим, як взяти участь у дослідженні, було отримано поінформовану згоду від усіх добровольців. Всі експерименти проводились відповідно до затверджених керівних принципів та норм.

Вилучення ДНК

Фекальну ДНК витягували за допомогою міні-набору для стільця QIAampDNA відповідно до вказівок виробника, із модифікованим протоколом попередньої обробки процедури збивання намистин, описаним Шнорром та ін. 20. Кількість ДНК визначали за допомогою Nanodrop ND-2000 (Nanodrop, США). Чистоту та якість геномної ДНК перевіряли на 0,8% агарозних гелях.

Посилення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та високопродуктивне секвенування

Гіпервариабельна область V4 бактеріального гена 16S рРНК була ампліфікована праймерами 515F (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) та 806R (GGACTACVSGGGTAT-CTAAT) 33. Для кожного зразка фекальної ДНК до 5 ′ кінців прямого та зворотного праймерів додавали 10-значну послідовність штрих-коду. ПЛР проводили на градієнті Mastercycler (Еппендорф, Німеччина) з використанням 50 мкл реакційного об'єму, що містить 5 мкл 10 × Ex Taq буфера (Mg 2+ плюс), 4 мкл 12,5 мМ dNTPmix (кожен), 1,25 U Ex Taq ДНК-полімерази, 2 мкл шаблону ДНК, 200 нМ штрих-кодованих праймерів з 967F і 1406R кожен, і 36,75 мкл ddH2O. Параметри циклу становили 94 ° C протягом 2 хв, а потім 30 циклів при 94 ° C протягом 30 с, 57 ° C протягом 30 с і 72 ° C протягом 30 с з кінцевим продовженням при 72 ° C протягом 10 хв. Три продукти ПЛР на зразок були об’єднані для пом’якшення упереджень ПЛР на рівні реакції. Продукти ПЛР очищали за допомогою набору для екстракції гелю QIAquick (QIAGEN, Німеччина) та кількісно визначали за допомогою ПЛР у реальному часі. Продукт ампліфікації був глибоко секвенсований за допомогою платформи Illumina MiSeq у BGI (Shen zhen). Після прогону аналіз зображення, базовий виклик та оцінка помилок проводились за допомогою Illumina Analysis Pipeline Version 2.6.

Аналіз даних

Спочатку були перевірені необроблені дані, а послідовності були вилучені з міркувань, коли вони охоплювали менше 200 bp. Ці дані представляли низьку якість балів ≤ 20 і містили неоднозначні основи або не точно відповідали послідовностям праймерів та тегам штрих-коду. Кваліфіковані зчитування були розділені на різні зразки з використанням специфічних для зразка послідовностей штрих-кодів та оброблені за допомогою аналізу трубопроводу Illumina версії 2.6. Далі набір даних було проаналізовано за допомогою QIIME 34. Послідовності були згруповані в OTU на рівні подібності 97% для формування кривих розрідження 35 та для обчислення індексів багатства та різноманітності 36. Засіб класифікатора RDP 37 використовувався для класифікації всіх послідовностей на різні таксономічні групи.

Основні OTU, представлені у всіх зразках, були виявлені за допомогою QIIME. Кластерний аналіз та PCA використовувались на основі інформації OTU з кожного зразка з використанням пакета R для вивчення подібності між різними зразками. Аналізи VENN також проводились із використанням пакету R. Статистичний аналіз між різними групами аналізували за допомогою ANOVA 38. U-тест Манна – Уїтні використовували для різноманітності та таксономічних порівнянь між групами на різних рівнях (тип, клас, порядок, сім’я та рід) 39. CCA використовували для оцінки зв'язків між мікробною структурою кишечника та атрибутами навколишнього середовища, використовуючи пакет R. LEfSe 40 був використаний для виявлення унікального бактеріального податку серед різних груп. Щоб визначити різні КНТ у всіх місцях, було проведено ієрархічне кластерування в КНТ на основі родового складу та чисельності згідно з методами, описаними DiGiulio та ін. 41 .

Наявність даних

Вихідні послідовності цього дослідження були депоновані в архіві читання послідовностей (номер приєднання: SRA551593).