Оцінка поліморфізмів FTO rs9939609 та MC4R rs17782313 як прогностичні біомаркери ожиріння: популяційне перехресне дослідження

Міна Мозафарізаде

1 Відділ клітинної та молекулярної біології Інституту вищої освіти Нур Данеш, Ісфахан, Іран

Мохсен Мохаммаді

2 Науково-дослідний центр гепатиту та кафедра фармацевтичної біотехнології фармацевтичного факультету Університету медичних наук Лорестан, Хоррамабад, Іран

Соха Садегі

1 Кафедра клітинної та молекулярної біології Інституту вищої освіти Нур Данеш, Ісфахан, Іран

Мортеза Хадізаде

3 Науково-дослідний центр фізіології, Інститут фундаментальних та клінічних фізіологічних наук Керманського університету медичних наук, Керман, Іран

Тайебе Талебзаде

4 Кафедра мікробіології, філія Варамін-Пішва Ісламського університету Азад, Варамін, Іран

Массуд Хушман

5 Департамент медичної генетики, Національний інститут генної інженерії та біотехнологій, Тегеран, Іран

Анотація

Завдання

Ожиріння є важливим фактором ризику для ряду хронічних захворювань, включаючи діабет, серцево-судинні захворювання та рак. Ожиріння зазвичай виникає внаслідок поєднання причин та факторів, що сприяють цьому, включаючи генетику та вибір способу життя. Багато досліджень показали взаємозв'язок однонуклеотидних поліморфізмів (SNP) з масою жиру та асоційованим із ожирінням (FTO) та генами рецептора меланокортину-4 (MC4R) з індексом маси тіла (ІМТ). Тому визнання основних генів та їх відповідних генетичних варіантів допоможе прогнозувати ризик ожиріння. Метою нашого дослідження було дослідити частоту поліморфізмів rs9939609 та rs17782313 у генах FTO та MC4R в іранській популяції.

Методи

Ми включили 130 пацієнтів із ожирінням та 83 контролі здорової ваги та обчислили їх ІМТ. Геномну ДНК екстрагували з периферичної крові, а частоту поліморфізмів rs9939609 та rs17782313 у генах FTO та MC4R визначали за допомогою системи ампліфікації тетра-праймера, тугоплавкої мутаційної системи-полімеразної ланцюгової реакції (ARMS-PCR).

Результати

Виявлено значні зв'язки між FTO rs9939609 та ІМТ. Де гомозиготні носії алелів ризику (A-A) мають значно вищий коефіцієнт шансів бути ожирінням, ніж особи з нормальним ІМТ (OR = 6,927, p Ключові слова: Генетичний поліморфізм, ожиріння, білок FTO, людина, рецептор меланокортину-4

Вступ

Метою нашого дослідження було дослідити зв'язок між FTO (rs9939609) та MC4R (rs17782313) поліморфізмами як можливими генетичними факторами індивідуальної сприйнятливості до ожиріння.

Методи

У дослідженні взяли участь 213 іранських добровольців, включаючи 130 людей із ожирінням та 83 здорових людей. Групи дослідження були відібрані незалежно від статі, рівня фізичної активності та сімейної історії ожиріння. Усі випадки були у віці старше 20 років. Досліджувані групи класифікували на три групи відповідно до їх ІМТ: нормальна/здорова вага (18,5 - 30).

Усі пацієнти дали свою поінформовану згоду, і всі процедури були затверджені Комітетом з етики Інституту вищої освіти Нур Данеш, Ісфахан, Іран. Коротко, 3 мл периферичної крові було зібрано і передано в лабораторію в стерильній соколиній пробірці.

Використовувані праймери полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) були розроблені за допомогою програмного забезпечення Oligo 7 після вирівнювання доступних послідовностей GenBank. Використовувані праймери наведені в таблиці 1. Загальну геномну ДНК витягували з периферичної крові за допомогою екстракційного набору GeNet Bio (GeNet Bio, Макрожен, Корея) відповідно до інструкцій виробника. Визначали концентрацію та чистоту ДНК, вилученої з кожного зразка, з подальшою спектрофотометрією OD 260/280 (NanoDrop, DeNovix Inc, Вілмінгтон, Делавер, США), а також якісною оцінкою ДНК на 1,5% агарозному гелі.

Таблиця 1

GenesForward праймер (5’ – 3 ’) Зворотний праймер (5’ – 3’)

FT0 rs9939609 внутрішній	CCTTGCGACTGCTGTGAATATA	CAGAGACTATCCAAGTGCATCTCA
FT0 rs9939609 зовнішній	GCTGCTATGGTTCTACAGTTCCA	TGTTCAAGTCACACTCAGCCTC
MC4R rs17782313 внутрішній	GAAGTTTAAAGCAGGAGAGATTGTATACC	GCTTTTCTTGTCATTTCCAGCA
MC4R rs17782313 зовнішній	TCCACATGCTATTGGTTTAAGACAA	TGCTGAGACAGGTTCATAAAAAGAG

FTO: маса жиру та пов’язане з ожирінням; MC4R: рецептор меланокортину-4.

Система ампліфікації вогнетривких мутацій тетра-праймера (ARMS) -PCR проводилася за допомогою системи Biometra GmbH (Biometra GmbH, Kat # 846-X070-141, Макрожен, Корея). Ампліфікацію проводили в реакційній суміші 25 мкл, що містить 1 мкл ДНК, 0,7 мкл кожного зовнішнього праймера FTO, 1 мкл кожного внутрішнього праймера FTO, 3 мкл кожного внутрішнього праймера MC4R, 1 мкл кожного внутрішнього MC4R, 0,5 мкл dNTP, 2,5 мкл буфера (10 разів), 1 мкл MgCl2 (1 мМ) і 0,2 мкл Taq полімерази. Обидва аналізи ПЛР проводили в оптимізованих умовах [Таблиця 2].

Таблиця 2

Гени Початковий цикл денатурації (32 цикли) Остаточне продовженняОдин цикл Денатурація Відпал Розширення Один цикл

FTO	95 o C - 5 хв	95 o C - 30 сек	58 o C - 30 сек	72 o C - 30 сек	72 o C - 5 хв
MC4R	95 o C - 5 хв	95 o C - 30 сек	59 o C - 30 сек	72 o C - 30 сек	72 o C - 5 хв

FTO: маса жиру та пов’язане з ожирінням; MC4R: рецептор меланокортину-4.

Продукти ПЛР оцінювали електрофорезом на 1,5% агарозному гелі, забарвленому гелевою плямою SYBR ® Safe DNA (Invitrogen). Також послідовність ПЛР-продуктів проводили на апараті генетичного аналізатора ABI PRISM® 3100 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific та Waltham, MA, США). Аналіз варіантів оцінювали за допомогою програми Finch TV (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA).

Статистичний аналіз проводили за допомогою SPSS (SPSS Inc., випущений 2007. SPSS для Windows, версія 16.0. Чикаго, SPSS Inc). Описові аналізи виражали як середнє значення ± стандартне відхилення. Для порівняння пропорцій груп використовували тести хі-квадрат та коефіцієнти коефіцієнтів (OR). Порівняння вважали статистично значущими, якщо p Таблиця 3] або страждали ожирінням (АБО = 6,927, p Таблиця 4], ніж особи зі здоровою вагою/контрольною групою. Більше того, не спостерігалося значної зв'язку між MC4R rs17782313 та ожирінням у порівнянні з особами зі здоровим ІМТ. Порівняно із пацієнтами зі здоровою вагою, пацієнти з алелем ризику MC4R (CC) мали вищі шанси ожиріння, ніж особи з алелями T (TT та TC) (OR = 1,889, p = 0,077, 95% ДІ: 0,92–3,84) [Таблиця 3 Аналіз продуктів Tetra ARMS-PCR на агарозному гелі показав смугу смуг 296 bp та 211 bp для rs9939609 та rs17782313 відповідно [Рисунок 1]. Результати, отримані в результаті секвенування, підтвердили вищезазначені результати. Для виявлення мутацій FTO та MC4R гени, інтрони секвенували та аналізували. Результати секвенування інтрону 1 гена FTO виявили два SNP у положеннях 207 (від G до A) та 231 (від T до A). Також SNP було знайдено у положенні 135 (від T до C ) гена MC4R [Рисунок 2].

Таблиця 3

Обговорення

Раніше досліджували вплив поліморфізмів FTO rs9939609 та MC4R rs17782313 на ожиріння. Автори дослідження виявили значний зв'язок між генотипами ризику FTO (AA + AT) та ІМТ (p = 0,03), а генотипи ризику MC4R (CC + CT) були пов'язані з більшим ІМТ (p = 0,03). 33

За погодженням з нашим дослідженням, автори іншого дослідження показали, що генотип A-A FRS rs9939609 був значно вищим у популяції ожиріння порівняно із суб'єктами нормальної ваги. 34 Крім того, автори не спостерігали значного зв'язку між поліморфізмами MC4R та ІМТ.

На відміну від цих даних, також повідомлялося, що суб'єкти з SN4 MC4R rs17782313 демонстрували позитивну зв'язок з ІМТ (p = 0,018). 2 Численні дослідження повідомили, що варіанти MC4R пов'язані з частотою ожиріння. 35-37

Ген FTO експресується на високому рівні в мозку та гіпоталамусі, регіоні, який, як відомо, відповідає за регуляцію апетиту. 38 Біохімічні дослідження показали, що мутація гена FTO як гена сприйнятливості до ожиріння може призвести до підвищеного ризику ожиріння. 14,15,27,28,30,39 Нещодавній звіт припускає, що пов'язані з ожирінням елементи в регіоні FTO взаємодіють з промотором гена гомеодомена білка 3 класу ірокезів (IRX3) і можуть контролювати експресію IRX3, отже, це можливо, що ген IRX3 також пов'язаний з ожирінням. 40 Крім того, мутації інтронів FTO гена FTO, пов’язаних із ожирінням, пов’язані з підвищеним ризиком розвитку багатьох хронічних захворювань, включаючи діабет ІІ типу та серцево-судинні захворювання. 26,39,41 Промотор IRX3, ген за кілька сотень тисяч пар основ, взаємодіє з інтронами FTO, пов’язаними з ожирінням, а також з великою кількістю інших елементів, тому ці інтрони діють як регулюючі елементи експресії IRX3, хоча дані свідчать, що сам ген FTO не грає ролі в цій взаємодії. 40 Мутації в рамках регуляторних елементів, що охоплюють хромосомні аномалії, включають транслокації, делеції, дуплікації, інверсії та анеуплоїдії до SNP і спричиняють різні захворювання людини. 42

MC4R є важливим геном-кандидатом для ожиріння. Цей рецептор, що складається з 322-амінокислот, кодується єдиним екзоном, розташований в хромосомі 18q22, і експресується на найвищих рівнях у мозку. 43 Мутації гена MC4R сприяють порушенню енергетичного гомеостазу, набору ваги та розвитку ожиріння. 44 Крім того, MC4R у центральній нервовій системі відіграє ключову роль у регуляції гомеостазу глюкози. Таким чином, мутації гена MC4R людини можуть впливати на рівень секреції інсуліну та призводити до гіперінсулінемії. 45 Широкі дослідження поліморфізму гена MC4R показали, що серед численних варіантів генотип rs17782313 був значно частішим та асоційованим із ожирінням. 20,31,45-47 Механізм зв’язку поліморфізму rs17782313 з ІМТ ще не з’ясований і вимагає подальшого вивчення. Тим не менше, різні дослідження показують, що кореляція між варіантом MC4R rs17782313 та великим споживанням енергії є значною. 24,44,46

Висновки

Ожиріння має багатофакторне походження, і його поширеність різко зросла, тому визначення генетичного поліморфізму генів може бути важливим підходом як маркер генетичної схильності до ожиріння для всіх груп населення. Наші дані підтверджують попередні спостереження, що носії генотипу А-А мають вищий ризик ожиріння порівняно з носіями генотипу А-Т і Т-Т. Ці знання можуть мати важливе значення в персоналізованих стратегіях управління способом життя для запобігання ожиріння у генетично сприйнятливих людей. Нарешті, ці результати свідчать про те, що оцінка генетичних поліморфізмів FTO та MC4R може розглядатися як прогностичний інструмент для виявлення людей з підвищеним ризиком розвитку ожиріння.

Розкриття інформації

Усі автори не заявляли про конфлікт інтересів. Фінансування для цього дослідження не отримано.

Подяка

Автори висловлюють подяку Іранському національному науковому фонду та Національному інституту генної інженерії та біотехнологій, Тегеран, Іран. Автори висловлюють свою вдячність усім учасникам за здачу зразків крові.