Захист міокарда від ішемії/реперфузійної травми екзогенним фрагментом галаніну

Метрики: PDF 762 переглядів | Перегляди HTML 1204 | ?

Андрій Тимотін, Олег Писаренко, Марія Сидорова, Ірина Студнева, Валентин Шульженко, Марина Палкеєва, Лариса Серебрякова, Олександр Молокоедов, Оксана Веселова, Матьє Сінато, Елена Троншере, Фредерік Боал та Оксана Кундузова _

Анотація

Андрій Тимотін 1, 2, Олег Писаренко 3, Марія Сидорова 3, Ірина Студнева 3, Валентин Шульженко 3, Марина Палкеєва 3, Лариса Серебрякова 3, Олександр Молокоєдов 3, Оксана Веселова 3, Матьє Сінато 1, 2, Елена Трончере 1, 2, Фредерік Боал 1, 2, *, Оксана Кундузова 1, 2, *

1 Національний інститут охорони здоров'я та медичних досліджень (INSERM), Тулуза, Франція

2 Тулузький університет, UPS, Інститут метаболічних та серцево-судинних захворювань, Тулуза, Франція

3 Російський кардіологічний науково-виробничий комплекс, Москва, Росія, Росія

* Ці автори зробили однаковий внесок у цю роботу

Ключові слова: галанін (2-11), серце, ішемія та реперфузія, енергетичний обмін, вироблення АФК

Отримано: 02 листопада 2016 р. Прийнято: 09 січня 2017 р. Опубліковано: 03 лютого 2017 р

Передумови та призначення: Галанін - це багатофункціональний нейропептид з плейотропними ролями. Це дослідження було розроблено для оцінки потенційного впливу галаніну (2-11) (G1) на функціональні та метаболічні відхилення у відповідь на травму ішемії-реперфузії міокарда (I/R).

Експериментальний підхід: Пептид G1 синтезували твердофазним методом на основі 9-флуоренілметоксикарбонілу (Fmoc). Хімічна структура була визначена за допомогою 1 H-ЯМР-спектроскопії та мас-спектрометрії. Експерименти проводились із використанням моделі щурів на пошкодженні I/R in vivo, ізольованих перфузійних серцях щурів ex vivo та культивованих клітинах кардіоміобласту щурів H9C2 щурів in vitro. Серцеву функцію, розмір інфаркту, енергетичний метаболізм міокарда, гемодинамічні параметри, рівні креатинкінази-MB (CK-MB) та лактатдегідрогенази (LDH) у плазмі крові вимірювали для оцінки впливу G1 на пошкодження I/R міокарда.

Ключові результати: Лікування G1 підвищувало життєздатність клітин залежно від дози, пригнічувало апоптоз клітин та надмірне вироблення активних форм кисню в мітохондріях (АФК) у відповідь на окислювальний стрес у клітинах H9C2. До- або постішемічна інфузія G1 посилювала функціональне та метаболічне відновлення під час реперфузії ішемізованого серця серця щурів. Введення G1 на початку реперфузії значно зменшило розмір інфаркту та рівень CK-MB та LDH у плазмі крові у щурів, які зазнали пошкодження міокарда в/в.

Висновки та наслідки: Ці дані дають перші докази кардіопротекторної активності галаніну G1 проти пошкодження В/М міокарда. Отже, пептид G1 може представляти перспективну стратегію лікування ішемічної хвороби серця.

ВСТУП

У цьому дослідженні ми оцінювали вплив G1 на пошкодження В/М міокарда на різних експериментальних моделях, включаючи кардіоміобласти, перфузійне ізольоване серце та серце на місці.

РЕЗУЛЬТАТИ

Вплив G1 на виживання клітин H9C2 у відповідь на стрес

Щоб визначити, чи впливає G1 на виживання клітин у відповідь на окислювальний стрес, ми дослідили дозозалежні ефекти пептиду на індуковану H2O2 втрату життєздатності кардіоміобластів, виміряну концентрацією АТФ. Як показано на малюнку 1, вплив клітин 400 мкМ H2O2 протягом 4 годин призвів до значного зниження життєздатності клітин порівняно з контролем. Дослідження реакції на дозу показали, що при дозі 50 і 250 нМ G1 зміг запобігти індукованому H2O2 зниженню виживання клітин. Далі ми дослідили, використовуючи термінальну дезоксинуклеотидилтрансферазу dUTP, мітку (TUNEL), чи впливає G1 на апоптотичну загибель клітин у відповідь на гіпоксичний стрес. Оскільки 50 нМ G1 давали приблизно на 20% збільшення життєздатності кардіоміобластів, ми використовували цю концентрацію в наступних експериментах. Як показано на малюнку 2, вплив клітин H9C2 на гіпоксію спричинив значне збільшення кількості TUNEL-позитивних клітин порівняно з нормоксією. Однак обробка клітин 50 нМ G1 суттєво зменшила індукований гіпоксією апоптоз (Рисунок 2A-2B).

Рисунок 1: Залежний від дози ефект G1 на виживання клітин у відповідь на окислювальний стрес. Лікування кардіоміобластів G1 запобігає зниженню життєздатності клітин, спричиненого H2O2, залежно від дози. H9C2 попередньо обробляли G1 (10, 50, 250 нМ) протягом 20 хв, а потім піддавали впливу 400 мкМ H2O2 протягом 4 годин. Значення - це середнє значення ± SEM для трьох експериментів. *** П §§ П Рисунок 2: Вплив G1 на індукований гіпоксією апоптоз клітин. A. Репрезентативні флуоресцентні зображення клітин H9C2, попередньо оброблених 50 нМ G1 протягом 20 хв, а потім піддані дії нормоксії або гіпоксії (1% O2) з подальшою реоксигенацією. Апоптоз вимірювали за допомогою TUNEL-аналізу в клітинах H9C2 через 16 годин гіпоксії з подальшим 4-годинним реоксигенацією. B. Кількісний аналіз TUNEL-позитивних клітин у клітинах H9C2. Значення - це середнє значення ± SEM з трьох експериментів. *** П §§§ П - ) виготовлення з використанням флуоресцентного зонда MitoSOX Red. Як показано на малюнку 3A-3B, вплив клітин на гіпоксичний стрес спричинив значне збільшення вироблення O2 у порівнянні з нормоксією. Важливо, що обробка клітин H9C2 50 нМ G1 помітно запобігала утворенню гіпоксією O2 - утворення (рис. 3A-3B).

Рисунок 3: Вплив G1 на індуковану гіпоксією мітохондріальну продукцію O2. A. Репрезентативні флуоресцентні зображення клітин H9C2, попередньо оброблених пептидом G1. Утворення мітохондріального O2 оцінювали MitoSOX Red у клітинах H9C2, що зазнали 16-годинної гіпоксії з наступним 4-годинним реоксигенацією. B. Кількісний аналіз вироблення мітохондріального О2 у клітинах H9C2, що зазнають дії нормоксиї або гіпоксії-реоксигенації. Значення - це середнє значення ± SEM з трьох експериментів. *** П §§§ П Рисунок 4: Залежний від дози ефект інфузії G1 на функціональне відновлення ізольованого серця щурів в кінці реперфузії. A. Дизайн дослідження, що включає три групи: 1 - контроль; 2 - вливання G1 перед ішемією; 3 - вливання G1 після ішемії; L - 5-хвилинна перфузія Лангендорфа зі швидкістю потоку 4 мл/хв до або після ішемії; N, робоча перфузія за методом Нілі. B. Вплив пептиду G1 на відновлення серцевого викиду (CO) в кінці реперфузії. C. Вплив пептиду G1 на індекс інтенсивності скорочувальної функції (тиск розвиненого лівого шлуночка (LVDP) × частота серцевих скорочень (HR)) на відновлення в кінці реперфузії. Значення виражаються як середні значення ± SEM з 8 експериментів.

Показники серцевої функції порівнювали в кінці реперфузії для доішемічної (G1-I) та постишемічної (G1-R) інфузії оптимальної концентрації G1 (240 мкМ) у таблиці 1. На додаток до відновлення СО, відновлення виходу аорти та ударний об'єм також був значно вищим у групі G1-R порівняно з групою G1-I. Посилене відновлення продукту LVDPxHR в обох групах G1 було обумовлено кращим відновленням HR та LVDP порівняно з контролем. Значне збільшення LVDP було спричинене помітним зниженням діастолічного тиску LV під час реперфузії. В обох групах G1 спостерігалося збільшення коронарного потоку із супутнім зменшенням коронарного опору порівняно з контролем. Дані в таблиці 1 показують, що відновлення серцевої функції було більш ефективним після введення G1 на початку реперфузії.

Таблиця 1: Вплив інфузії 240 мкМ G1 до (G1-I) та після глобальної ішемії (G1-R) на відновлення ізольованих нагрівань щурів в кінці реперфузії