Вплив дієти з високим вмістом жиру, збагаченої салом або риб’ячим жиром, на гіпоталамічну АМП-активовану білкову кіназу та запальні посередники

Емануела Віджано

1 Відділ експериментальної медицини - Секція фізіології людини, Другий університет Неаполя, Неаполь, Італія

2 Медичний факультет Падуанського університету, Падуя, Італія

Марія Піна Молліка

3 Відділ біології Неаполітанського університету імені Федеріко II, Неаполь, Італія

Лілла Ліонетті

3 Відділ біології Неаполітанського університету імені Федеріко II, Неаполь, Італія

Джина Кавальєре

3 Відділ біології Неаполітанського університету імені Федеріко II, Неаполь, Італія

Джованна Трінчезе

3 Відділ біології Неаполітанського університету імені Федеріко II, Неаполь, Італія

К'яра Де Філіппо

3 Відділ біології Неаполітанського університету імені Федеріко II, Неаполь, Італія

Серхіо К'єффі

1 Відділ експериментальної медицини - Секція фізіології людини, Другий університет Неаполя, Неаполь, Італія

Марчелло Гайта

3 Відділ біології Неаполітанського університету імені Федеріко II, Неаполь, Італія

Антоніо Барлетта

3 Відділ біології Неаполітанського університету імені Федеріко II, Неаполь, Італія

Бруно Де Лука

1 Відділ експериментальної медицини - Секція фізіології людини, Другий університет Неаполя, Неаполь, Італія

Маріанна Кріспіно

3 Відділ біології Неаполітанського університету імені Федеріко II, Неаполь, Італія

Марчелліно Монда

1 Відділ експериментальної медицини - Секція фізіології людини, Другий університет Неаполя, Неаполь, Італія

Пов’язані дані

Анотація

Вступ

Ожиріння та діабет є основними причинами захворюваності та смертності в західному світі і можуть призвести до запальних реакцій та окисного стресу в периферичних тканинах (Hotamisligil, 2006). Деякі дані вказують на те, що захворювання, пов'язані з переїданням, також пов'язані із запаленням та підвищеним рівнем активних форм кисню (АФК) у мозку (Cai, 2009). Гіпоталамус - це область мозку, що відповідає за різноманітні метаболічні регулятори, і багато захворювань, пов’язаних із переїданням, етіологічно пов’язані з дерегуляцією нейронів гіпоталамусу, які дуже вразливі до харчового окисного стресу та запалення (Cai, 2009). Було продемонстровано, що переїдання може активувати IKKβ/NF-κB в медіобазальній ділянці гіпоталамуса, що є областю, що визначає стан харчування та регулює обмін речовин (Zhang et al., 2008). IKKβ/NF-κB є головним вимикачем та центральним регулятором вродженого імунітету та суміжних функцій. Деякі дослідження припускають, що IKKβ/NF-κB, як медіатор метаболічного запалення, може представляти зв'язок між переїданням та дисфункціями сигналів гіпоталамусу, що викликають ожиріння та пов'язані з цим проблеми (Zhang et al., 2008).

Одним з потужних контррегуляторів запальних сигнальних шляхів є аденозинмонофосфатзалежна кіназа (AMPK; Salt and Palmer, 2012; Hernández-Aguilera et al., 2013). AMPK, еволюційно збережена серин/треонінкіназа, є гетеротримерним комплексом, утвореним каталітичною α-субодиницею та регуляторними β та γ-субодиницями. Фосфорилювання α-субодиниці в Thr172 перетворює AMPK в активовану форму pAMPK. AMPK - це датчик стану клітинної енергії, який, активуючись метаболічним стресом, здатний підтримувати клітинний енергетичний гомеостаз, повертаючи катаболічні шляхи (Hardie, 2014).

Кілька досліджень продемонстрували, що AMPK у гіфоталамусі регулює споживання їжі і що його активність модулюється кількома гормонами, такими як лептин, адипонектин та інсулін. Оскільки ці гормони беруть участь у контролі маси тіла та метаболізму глюкози та ліпідів, ці результати свідчать про те, що AMPK може служити ефектором лептину та інсуліну нижче, і таким чином відігравати роль сигнальної молекули під час метаболічних реакцій, індукованих гормонами. Тоді як лептин пригнічує активність AMPK в дугоподібних і паравентрикулярних ядрах гіпоталамуса, відомо, що інсулін інгібує активність AMPK у бічній, вентромедіальній та дорсомедіальній областях гіпоталамуса (Minokoshi et al., 2004). Всі ці ділянки мозку беруть участь у контролі над вживанням їжі (Monda et al., 1993; Viggiano et al., 2006) та у витратах енергії (Monda et al., 1996; Messina et al., 2013).

Поліненасичені жирні кислоти ω-3 (PUFA), докозагексаєнова кислота (DHA) та ейкозапентаенова кислота (EPA) - це дієтичні сполуки, які інтенсивно вивчаються як потужні протизапальні продукти, здатні зменшити ризик резистентності до інсуліну та полегшити асоційоване з ожирінням порушення, що впливають на гормональний контроль та модулюють активність AMPK (Xue et al., 2012; Martínez-Fernández et al., 2015). Нещодавно ми продемонстрували, що заміна свинячого жиру, багатого насиченими жирними кислотами (SFA), риб’ячим жиром (багатим ω-3 ПНЖК) у дієті з високим вмістом жиру (HFD) здатна обмежити розвиток системного запалення та запалення тканин., стеатоз печінки та для послаблення резистентності до інсуліну (Lionetti et al., 2014a, b; Cavaliere et al., 2016).

Тут ми протестували на рівні гіпоталамусу ефект заміщення насичених ненасиченими жирними кислотами на AMPK, активований AMPK (pAMPK на Thr 172), IKKβ, запалення та окислювальний стрес. Більше того, ми також проаналізували на тих же тваринах участь інсуліну, лептину та запальних показників у модуляції АМФК.

Матеріали та методи

Всі хімічні речовини були придбані компанією Sigma – Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США), якщо не вказано інше. Молоді самці щурів Wistar (віком 60 днів; 345 ± 7 г; річка Чарльз, Калько, Лекко, Італія) знаходились в індивідуальній клітці в кімнаті з контрольованою температурою і піддавалися щоденному циклу 12/12 год світло/темрява із вільним доступом до чау дієта і питна вода. Щурів було розділено на три експериментальні групи (n = 8) відповідно до різного 6-тижневого режиму харчування: перша група (контрольна дієта, CD) отримувала стандартну дієту (10,6% жиру J/J); друга група (LD) отримувала HFD, багату салом (40% жиру J/J); а третя група (FD) отримувала HFD, багату риб'ячим жиром (40% жиру J/J). Склад усіх дієтичних режимів наведено в таблиці Таблиця1 1 .

Таблиця 1

Склад дієти.

Контрольна дієта HFD, багата салом (дієта г/100 г) HFD, багата риб'ячим жиром (дієта г/100 г)

Стандартний корм	100	51.30	51.30
Казеїн a g	-	9.25	9.25
Сало g	-	21.80	-
Риб’ячий жир b g	-	-	21.80
Соняшникова олія g	-	1.24	1.24
AIN 76 мінеральна суміш c g	-	1.46	1.46
AIN 76 вітамінна суміш d g	-	0,42	0,42
Бітартрат холіну	-	0,08	0,08
Метіонін g	-	0,12	0,12
Щільність енергії кДж/г дієти	15,88	20	20
Білок%	29	29	29
% Ліпідів	10.60	40	40
Вуглеводи%	60,40	31	31

a Очищений казеїн з високим вмістом азоту, що містить 88% білка, b Риб'ячий жир = Олія печінки тріски, c Американський інститут харчування (1977), d Американський інститут харчування (1980).

Протягом експериментального періоду щодня контролювали вагу тіла та споживання їжі, щоб підрахувати приріст маси тіла та загальне споживання енергії. Пролиту їжу збирали та компенсували під час коректування розрахунку споживання їжі. Щільність валової енергії для стандартного або HFD (15,8, або 20 кДж/г відповідно) визначали калориметром бомби (адіабатичний калориметр Parr, Parr Istrumentes Co, Moline, IL, США).

Інший набір CD, LD та FD тваринам (n = 5 на групу) через 6 тижнів лікування вводили внутрішньовенно. з інсуліном (гомолог швидкої дії, 10 одиниць/кг маси тіла; Novartis, Базель, Швейцарія).

В кінці експериментальних обробок щурів знеболювали внутрішньовенно. ін'єкція хлоралгідрату (40 мг/100 г маси тіла), обезголовлена гільйотиною, і кров брали з нижньої порожнистої вени. Гіпоталамус швидко видаляли з мозку і переносили у відповідний буфер. Всі зразки, які не були використані негайно, зберігали при -80 ° C.

Параметри сироватки

Рівні холестерину, тригліцеридів, NEFA та глюкози в сироватці крові вимірювали стандартними процедурами. Рівні інсуліну в сироватці крові (Mercodia AB, Уппсала, Швеція), TNF-α (Biovendor R&D, Брно, Чеська Республіка), адипонектину та лептину (B-Bridge International Mountain View, CA, USA) вимірювали за допомогою комерційно доступних наборів ELISA.

Аналіз перекисного окислення ліпідів

Для визначення перекисного окислення ліпідів у гомогенаті гіпоталамусу вимірювали рівень малонового диальдегіду (МДА) методом реакції тіобарбітурової кислоти (ТБАР). MDA реагує з тіобарбітуровою кислотою (TBA), утворюючи рожевий хромоген, який виявляється на довжині хвилі 532. Значення MDA виражали як наномолі на міліграм білка мозку (Lu et al., 2009).

Активовані ферментом активність відновленого стану та ядерного фактора Еритроїд 2-фактор (Nrf2)

Знижені концентрації глутатіону (γ-L-глутаміл-L-цистеїніл-гліцин, GSH) та окисленого концентрації глутатіону (γ-глутаміл-L-цитеїнілгліцин, GSSG) у гіпоталамусі вимірювали за допомогою дітіонітробензойної кислоти (DTNB) (Бергамо та ін., 2007); співвідношення GSH/GSSG використовували як маркер окисного стресу. Ферментативну активність глутатіон-S-трансферази (GST) та NAD (P) H-хінон-оксидоредуктази (NQO1) оцінювали спектрофотометрично у цитоплазматичних екстрактах мозку за стандартними протоколами (Benson et al., 1980; Levine et al., 1990).

Вестерн-клякса

Гіпоталамус гомогенізували в буфері для лізису (10 мМ HEPES, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 12% гліцерину, 0,5 мМ DTT, 0,1 мМ EGTA) з коктейлем інгібіторів протеази (Sigma Aldrich). Білки (20 або 40 мкг/провулок) розділяли на 12% SDS-PAGE і переносили в нітроцелюлозні мембрани. Плямки інкубували з моноклональними антитілами кролика AMPKα (Технологія клітинної сигналізації; розведення 1: 1000), моноклональними антитілами кролика pAMPKα (Thr172) (Технологія клітинної сигналізації; розведення 1: 1000), моноклональними антитілами кролика IKK-β (Abcam; розведення 1: 500) або мишаче антитіло до α-тубуліну (Sigma Aldrich; розведення 1: 1000) протягом ночі при 4 ° C, а потім із вторинним антитілом проти IgG кролика або миші (Promega; розведення 1: 2500) протягом 1 год при RT. Сигнали візуалізувались за допомогою системи ECL (Пірс). Рівень експресії α-тубуліну використовували для нормалізації даних.

Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою SPSS 13.0 (SPSS Inc., Чикаго, Іллінойс, США). Для оцінки відмінностей між групами використовували ANCOVA або один із способів ANOVA, за яким слідував спеціальний тест Тукі. Значення Р менше 0,05 вважали статистично значущими.

Заява про етику

Процедури, що стосуються тварин та догляду за ними, проводились відповідно до міжнародного та національного законодавства та політики (Директива ЄС 2010/63/ЄС про експерименти на тваринах, керівні принципи ARRIVE та Базельська декларація, включаючи концепцію 3R). Процедури, про які повідомляється тут, були затверджені Інституційним комітетом з етики експериментів на тваринах (CSV) Неаполітанського університету Федеріко II та Міністром делла Салют .

Результати

Вплив дієти з високим вмістом жиру, збагаченої салом або риб'ячим жиром, на збільшення маси тіла та споживання енергії

Рисунок Рисунок 1 1 повідомляє про зміну маси тіла, щоденного споживання їжі (г/день) та споживання енергії у щурів, які годували LD або FD, порівняно з CD протягом 1–6 тижнів лікування. У кожен момент часу маса тіла була вищою у ЛД порівняно з КР, але різниця була статистично значущою лише через 5 і 6 тижнів лікування (рис. (Рис. 1А). 1А). З іншого боку, три групи щурів не продемонстрували жодної різниці в щоденному споживанні їжі (г/дієта, рисунок Рисунок 1В). 1B). тоді як споживання енергії (кДж/дієта) було значно вищим у групах LD та FD порівняно з групою CD у кожен момент часу (Рисунок (Figure1C 1C).

Вплив дієти з високим вмістом жиру, збагаченої салом або риб'ячим жиром, на масу тіла, споживання їжі та споживання енергії. Вага тіла (A), споживання їжі (B) і щоденне споживання енергії (C) протягом 6 тижнів лікування контрольною дієтою (CD), дієтою, збагаченою риб’ячим жиром (FD), або дієтою, збагаченою салом (LD). Значення виражаються як Середнє ± SEM. # P Малюнок 2, 2, HFD, збагачений риб'ячим жиром протягом 6 тижнів, значно збільшив базальну глікемію порівняно з CD (P (Рисунок 3). 3). Щоб дослідити вплив HFD на активність цього білка, ми також проаналізували рівень експресії pAMPK (фосфорильована активна форма AMPK) і не спостерігали ніякої різниці між групами FD та CD (Рисунок (Рисунок 3), 3 ), вказуючи на те, що збагачена риб’ячим жиром дієта не змінила рівень експресії гіпоталамуса АМРК та рівень його активації. Цікаво, однак, рівень експресії pAMPKα суттєво збільшився у групі LD порівняно з групою FD (Рисунок (Малюнок 3 3).

Вплив дієти з високим вмістом жиру, збагаченої салом або риб'ячим жиром, на гіпоталамічну IKKβ

Для дослідження молекулярних механізмів, що лежать в основі HFD-залежної активації AMPK, ми проаналізували рівень експресії IKKβ (активатора шляху NFKB) в гіпоталамусі оброблених тварин. Ми не спостерігали значних змін цього медіатора в групах LD або FD порівняно з CD, що свідчить про те, що механізм, індукований дієтою, збагаченою LD, і призводить до активації гіпоталамусного AMPK не залежить від IKKβ (дані не наведені).

Вплив дієти з високим вмістом жиру, збагаченої салом або риб'ячим жиром, на запалення та окислювальний стрес у гіпоталамусі

HFD, збагачений LD, спричинює збільшення окисного стресу в гіпоталамусі, що продемонстровано значним збільшенням MDA (P (рис. 4). 4). Крім того, незначні відмінності в активності GST та NQO1 у групах LD та FD порівняно з CD вказували на те, що шлях Nrf2 не бере участь у опосередкованій HFD модуляції окислювально-відновного стану (дані не наведені).

Вплив дієти з високим вмістом жиру, збагаченої салом або риб'ячим жиром, на окислювальний стрес гіпоталамусу. Рівні гіпоталамусу малонового диальдегіду (MDA, A), TNF-α (B), відновлений глутатіон (GSH, C.) та співвідношення відновлений/окислений глутатіон (GSH/GSSG, D) у тварин, які протягом 6 тижнів отримували контрольну дієту (CD), дієту, збагачену риб’ячим жиром (FD), або дієту, збагачену салом (LD). Значення виражаються як Середнє ± SEM. * P (67K, jpeg)