Тривала дієта з високим вмістом солі спричиняє гіпертонію та зменшує експресію нирок фактору росту судинного ендотелію у щурів Спраг-Доулі

Анотація

Ми прагнемо визначити: 1) чи тривала дієта з високим вмістом солі викликає гіпертонію та пошкодження нирок у щурів Спраг-Доулі (SD) та 2) чи асоційована гіпертонія та пошкодження нирок, спричинені дієтою з високим вмістом солі, пов’язані зі зниженням експресії VEGF у нирках. Дванадцять 10-тижневих самців щурів SD отримували дієту з високим вмістом солі (ГС, 8%), а дванадцять щурів СД отримували нормальну сольову дієту (NS, 0.5%) протягом 8 тижнів. Використовуючи хвостову манжету, щотижневий моніторинг показав, що артеріальний тиск значно підвищувався через 6, 7 та 8 тижнів у групі ГС порівняно з групою НС (Р довготривала дієта з високим вмістом солі, щур Спрег-Доулі, гіпертонія, нирковий VEGF

Вступ

Виходячи з усіх вищезазначених висновків, ми припускаємо, що тривала дієта з високим вмістом солі може спричинити пошкодження нирок та гіпертонію, що пов’язано зі зниженням експресії VEGF у нирках у нормотенсивних гризунів, таких як щури Спраг-Доулі. У цьому дослідженні ми прагнемо визначити: 1) чи викликає довготривала дієта з високим вмістом солі (8 тижнів) гіпертонію та пошкодження нирок у щурів Спраг-Доулі (SD) та 2) чи викликає гіпертонія та ниркові захворювання, спричинені дієтою з високим вмістом солі травми пов'язані зі зниженням експресії VEGF у нирках.

Методи

Протокол тварин

Вимірювання артеріального тиску

Протягом 8-тижневого експериментального періоду систолічний артеріальний тиск вимірювали щотижня у щурів NS та HS SD (n = 12 у кожній групі) методом плетизмографії хвоста (IITV, Inc). Через 4 тижні або 8 тижнів експерименту обидві групи щурів SD (n = 6 у кожній групі) знеболювали за допомогою інгаляції ізофлурану за допомогою газового випарника (Гарвардський апарат, Холлістон, Массачусетс). За допомогою асептичних методів мікрокатетер поміщали в сонну артерію і направляли під шкіру до задньої частини шиї та закріплювали. Через два дні після того, як щури оговталися від операції, катетер був підключений до комп'ютеризованої системи моніторингу, що називається PowerLab (AD Instruments, Касл-Гілл, Австралія), щоб постійно реєструвати MAP і частоту серцевих скорочень (ЧСС) у свідомих щурів SD 4 години на добу. протягом 2 днів. Вимірювання MAP та HR у кожної щури проводили одночасно, і всі значення для кожної щури представляли середнє значення 4 годин/добу за 2 дні вимірювань.

Аналіз північного плями

Загальну РНК готували з нирок щурів SD (n = 6 у кожній групі) після 8 тижнів нормальної сольової або високосольової дієти із застосуванням модифікованого методу на основі гуанідинію (комплект для виділення загальної РНК, Ambion, Austin, TX), як описано раніше (34). Геномну ДНК видаляли обробкою ДНКазою I без РНКази з наступною екстракцією фенол/хлороформ та осадженням етанолом. Цілісність РНК перевіряли на агарозному гелі MOPS-формальдегід перед синтезом кДНК. Експресія мРНК VEGF у нирках досліджувалася за допомогою Норт-блоттингу, як описано раніше (34). Зондом кДНК VEGF був 580-п.н. EcoR I-BamH I фрагмент мишачої кДНК VEGF, який був клонований у плазміду pBluescrip. Зонд кДНК маркували α- 32 P-dCTP (New England Nuclear, Бостон, Массачусетс), використовуючи багатопрофільний набір для маркування ДНК із випадковим грунтуванням (Amersham, Великобританія). Квантування експресії мРНК VEGF проводили на фосфорних зображеннях плям, які були зібрані за допомогою фосфорно-візуалізатора (Molecular Dynamics; програмне забезпечення: ImageQuant 3.3, Molecular Dynamics). Для перевірки відносної кількості загальної РНК фільтри гібридизували з 32-міченим 28S рРНК антисмисловим олігонуклеотидним зондом (Ambion). Експресія мРНК VEGF нормалізувалась щодо 28S рРНК у кожному зразку.

Вимірювання рівня білка VEGF та sFlt-1 методом ІФА

Рівні білка VEGF та sFlt-1 у плазмі, сечі та цілій нирковій тканині щурів SD визначали за допомогою мишей VEGF та мишей sFlt-1 ELISA набори (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота), відповідно до інструкцій виробника. Зразки тканин цілих нирок гомогенізували в крижаному буфері PBS, що містить коктейль інгібітора протеази, а загальні білки екстрагували за допомогою реагентів цитоплазматичної екстракції NE-PER (Pierce, Rockford, IL), згідно з протоколом виробника. Ці екстракційні реагенти не впливали на вимірювання білків тканин цих цитокінів порівняно з іншими звичайними методами екстракції білка. Загальну концентрацію білка в супернатанті тканини визначали за допомогою білкового аналізу Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія). Рівні білка VEGF у цілих тканинах нирок нормалізувались та виражали у пікограмах на міліграм загального білка тканини.

Гістологічний аналіз за допомогою світлової мікроскопії

Середньокоронові зрізи лівих нирок, зібрані як з нормальних груп, що харчуються солею, так і з високим вмістом солі, фіксували у буферному формаліні та вкладали у парафін для гістологічних досліджень, як описано раніше (20, 35). Зразки розрізали на зрізи по 3 мкм і фарбували періодичним реагентом кислоти-Шиффа (PAS) з подальшим протизабарвленням гематоксиліном. Всі зрізи аналізували за допомогою напівкількісної гістологічної оцінки (0 = відсутня, 1+ = легка, 2+ = помірна та 3+ = важка) на вираженість тубулоінтерстиціальної інфільтрації із запальними клітинами, вогнищевого сегментарного гломерулосклерозу, пошкодження тубулоінтерстиціалу та розширення позаклітинного матриксу. . Середню площу клубочків у зрізах, забарвлених PAS, визначали від 30 до 40 клубочків у кожній нирці на екрані комп'ютера за допомогою програмного забезпечення Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD).

Статистичний аналіз

Всі визначення проводились у дубльованих наборах. Де вказано, дані подаються як середнє значення ± SE. Статистично значущі відмінності середніх значень між двома групами були перевірені за допомогою непарного t-критерію Стьюдента. ANOVA використовували для аналізу відмінностей між двома групами з кількома порівняннями. Значення P Рисунок 1 A. демонструє, що при щотижневому моніторингу артеріального тиску за допомогою хвостової манжети не спостерігається значної різниці в систолічному артеріальному тиску протягом 1-5 тижнів між групами НС та ГС щурів SD, але систолічний артеріальний тиск значно зростає через 6, 7 та 8 тижнів Група HS, порівняно з групою NS (P Рисунок 1B вказує, що 4 тижні дієти з високим вмістом солі (8%) не суттєво змінює MAP у щурів SD у порівнянні з щурами SD, які мають нормальну сольову дієту (123 ± 6,1 проти 118 ± 2,7 мм рт. Ст.; N = 6; P> 0,05); однак після 8 тижнів дієтичної програми MAP є значно вищим у ГС, ніж у групі NS (140 ± 5,3 проти 112 ± 2,2 мм рт. Ст.; N = 6; P 0,05). Суттєвої різниці у масі тіла між групами HS та HS не було (370,0 ± 8,9 проти 359,3 ± 8,0 г; n = 6; P = 0,41).