Терапевтичне застосування міцелярного солюбілізованого ксантогумолу в моделях миші ожиріння, діабету та неалкогольної жирної хвороби печінки, спричиненої дієтою

Абдо Махлі

1 Інститут біохімії (Центр Еміля-Фішера), Університет Фрідріха-Олександра, Ерланген-Нюрнберг, Фарстр. 17, D-91054 Ерланген, Німеччина; [email protected] (А.М.); [email protected] (T.S.); [email protected] (K.F.)

Тетяна Сейц

Кім Фріз

Ян Франк

2 Інститут харчових наук, Університет Гогенхайма, Гарбенстр. 28, D-70599 Штутгарт, Німеччина; [email protected]

Ральф Вейскірхен

3 Інститут молекулярної патобіохімії, експериментальної генної терапії та клінічної хімії (IFMPEGKC), Університетська лікарня RWTH Аахен, D-52074 Аахен, Німеччина; ed.nehcaaku@nehcriksiewr

Мона Абдель-Таваб

4 Центральна лабораторія німецьких фармацевтів, вул. Карла-Манніха. 20, D-65760 Ешборн, Німеччина; [email protected]

Даріуш Бехнам

5 AQUANOVA AG, Біркенвег 8-10, D-64295 Дармштадт, Німеччина; [email protected]

Клаус Хеллербранд

Анотація

1. Вступ

Термін "метаболічний синдром" означає одночасне виникнення декількох супутніх захворювань, пов'язаних із ожирінням. На додаток до інсулінорезистентності при цукровому діабеті 2 типу (T2DM), дисліпідемія та гіпертонія є компонентами метаболічного синдрому. Більше того, майже у всіх випадках ожиріння пов'язане зі значним накопиченням ліпідів у печінці. Ця форма стеатозу печінки визначається як неалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) і сьогодні розглядається як печінковий прояв метаболічного синдрому. NAFLD охоплює широкий спектр патологічних станів. Гепатоцелюлярне накопичення ліпідів є першим патологічним етапом НАЖХП. Простий стеатоз може переростати із запаленням до (неалкогольного) стеатогепатиту (НАСГ). У своїй запущеній формі НАСГ характеризується некрозапаленням та прогресуючим фіброзом [1]. Останній може перерости в цироз. На сьогодні НАЖХП визнана найпоширенішим захворюванням печінки в західних країнах [2].

Кожен патологічний етап НАЖХП є наслідком і викликається (метаболічним) метаболічним синдромом, відповідно. При цьому покращення (компонентів) метаболічного синдрому також покращує НАЖХП.

В даний час відсутні ефективні стратегії лікування НАЖХП. Більшість пацієнтів погано реагують на заходи щодо зниження ваги [3]. Хірургічні втручання, такі як шлунковий шунтування або зменшення шлунка (баріатрична хірургія), є найефективнішими заходами для постійної втрати ваги [4], які також позитивно впливають на розвиток та прогресування НАЖХП [5]. Однак, з огляду на інвазивність та витрати, ці хірургічні втручання застосовні лише для меншості осіб із патологічним ожирінням. З іншого боку, фармакологічна терапія T2DM (наприклад, сульфонілсечовина, метформін або агоністи GLP-1) часто є лише частково ефективною і страждає від серйозних побічних ефектів [6]. Отже, існує велика клінічна потреба у нових фармакологічних терапевтичних підходах для стійкого безпечного схуднення та довгострокового поліпшення (симптомів) метаболічного синдрому.

Ксантогумол (3 '- [3,3-диметилаліл] -2', 4 ', 4-тригідрокси-6'-метоксихалкон) - основний пренільований халкон жіночих суцвіть (шишок хмелю), присутній у невеликій кількості в пиві [ 7]. Повідомлялося про декілька корисних для здоров'я ефектів ксантогумолу, таких як хіміопрофілактична та протизапальна активність (розглянуто в [8]). Зовсім недавно було показано, що ксантогумол зменшує адипогенез та покращує метаболізм ліпідів та глюкози на мишачих моделях гіперліпідемії, ожиріння та T2DM [9,10,11]. Більше того, ми раніше показали, що ксантогумол пригнічує запалення печінки та фіброз на мишачих моделях НАЖХП [12]. Крім того, ми та інші виявили, що ксантогумол пригнічує запалення печінки та фіброз також на моделях гепатоцелюлярних пошкоджень, не пов'язаних з метаболічним синдромом [13,14,15]. Це вказує на те, що ксантогумол також проявляє прямий інгібуючий вплив на запальні та фіброгенні механізми в печінці (клітинах).

Примітно, що у всіх цих дослідженнях XN вводили з самого початку експерименту, тобто одночасно із введенням обезогенної або індукуючої НАЖХП дієти, яка імітує профілактику захворювання. Однак це не відображає ситуації з ожирінням пацієнтів, які вже страждають від медичних захворювань на початку покращаючих втручань. Крім того, незважаючи на перспективні наслідки для здоров'я, терапевтичне використання XN може бути обмежене через низьку біодоступність у пероральній формі [16].

У цьому дослідженні ми мали на меті проаналізувати ефект міцелярної солюбілізації ксантогумолу (s-XN) у доклінічній миші на моделі ожиріння, викликаного дієтою, діабету та НАЖХП [17]. На основі попередніх досліджень, що успішно застосовували міцелярну солюбілізацію інших поліфенолів для підвищення їх пероральної біодоступності [18,19,20,21], ми обрали добову дозу від 2,5 мг/кг т. Е., Тобто більш ніж у 10 разів нижчу за ефективну дози, про які повідомлялося в попередніх дослідженнях in vivo. Для порівняння ми також застосували ту саму дозу ксантогумолу в його природній формі (n-XN). На відміну від більшості попередніх досліджень, ксантогумол вводили не через (змішування в) чау, а через щоденний пероральний введення, щоб гарантувати точне дозування. Крім того, мишей годували дієтою західного типу, яка індукує ожиріння та НАЖХП, вже за 3 тижні до початку введення ксантогумолу для імітації терапевтичного втручання, а не профілактики.

2. Матеріали та методи

2.1. Хімікалії

Міцелярний ксанто-флав-солюбілізат (EW0192/B, 10% об/об; s-XN) та нативний екстракт ксантогумолу (92% м/м; n-XN) були надані AQUANOVA AG (Дармштадт, Німеччина). Для розчинення нативного ксантогумолу був підготовлений водний розчин метилгідроксипропілцелюлози (MHPC, 0,2%, Methocel E4M Premium CR, Hypromellose 2910 USP, Fagron Inc., St. Paul, MN, USA).

2.2. Тварини та тваринна модель

Восьмитижневі самці мишей C57BL/6 (лабораторії Charles River; Сульцфельд, Німеччина). Мишей розміщували в приміщенні, контрольованому 22 ° C, під час 12-годинного циклу світло-темрява з вільним доступом до їжі та води. Експерименти з використанням житла та тварин проводились відповідно до національних та міжнародних рекомендацій Європейського Союзу (ЄС) з відповідного дозволу місцевого самоврядування (55.2-2532-2-196). Через 1 тиждень акліматизації мишей розділили на чотири групи (по 6 мишей на групу); мишей годували або стандартною дієтою (контроль), або дієтою західного типу (WTD) протягом трьох тижнів. Стандартна дієта містила 4,9% сирої клітковини, 6,4% сирої золи, 19% сирої білка, 3,3% жиру та 58% вуглеводів (сахароза 4,7% та крохмаль 36,5%); WTD збагатився свинячим салом (15%), яловичим жиром (15%), пальмітиновою кислотою (4%), стеариновою кислотою (4%), холестерином (0,2%) та сахарозою (30%) [17]. Обидві дієти на гризунах були підготовлені Ssniff (Соест, Німеччина).

Згодом мишей, які годували WTD, обробляли або n-XN, або s-XN, або носієм (VH) на оральний манометр щодня протягом додаткових 8 тижнів. Після 11 тижнів контролю або годування з використанням ЗМТ мишей забивали, а тканини печінки та крові відбирали для подальшого аналізу.

2.3. Внутрішньочеревинний тест на толерантність до глюкози (ipGTT)

Після 7 тижнів перорального введення n-XN або s-XN проводили ipGTT, як описано раніше [22]. Коротко кажучи, після 12-годинного голодування мишам внутрішньочеревно вводили глюкозу (50% мас./Розчин, 3 мг (глюкоза)/г маси тіла). Концентрацію глюкози в крові вимірювали у зразках, відібраних з хвостової вени до (глюкоза натще) та через 30, 60, 90 та 120 хв після введення глюкози, використовуючи глюкометр Accutrend (Roche, Мангейм, Німеччина).

2.4. Аналіз вмісту клітинних ліпідів

Витягували печінкові ліпіди і кількісно визначали рівні тригліцеридів за допомогою набору GPO-тригліцеридів (Sigma, Дейзенгофен, Німеччина), як описано [23,24].

2.5. Аналіз експресії РНК

Виділення РНК із тканин печінки та зворотну транскрипцію проводили, як описано [25]. Кількісну ПЛР в реальному часі проводили із застосуванням технології LightCycler (Roche) [26] та наступних пар праймерів: Мишачий колаген I (прямий: 5′-CTG TTC CAG GCA ATC CAC GA -3 ′; зворотний: 5′-ATC AGC TGG AGT TTC CGT GC-3 ′), мишачий cxcl1 (вперед: 5′-ACC GAA GTC ATA GCC ACA CTC-3 ′; реверс: 5′-CTC CGT TAC TTG GGG ACA CC-3 ′), мишачий mcp1 ( вперед: 5′-TGC AGG TCC CTG TCA TGC TTC-3 ′; реверс: 5′-TGG ACC CAT TCC TTC TTG GGG T-3 ′) і мишачий α-SMA (вперед: 5′-CCA GCC ATC TTT CAT TGG GAT-3 ′; реверс: 5′-CCC CTG ACA GGA CGT TGT TA-3 ′). Ампліфікація кДНК, отриманої з 18s рРНК (пряма: 5′-AAA CGG CTA CCA CAT CCA AG-3 ′; зворотна: 5′-CCT CCA ATG GAT CCT CGT TA-3 ′), була використана для нормалізації.

2.6. (Імуно) Гістологічний аналіз

Для гістологічних аналізів зразки тканин печінки мишей фіксували протягом 24 годин у 4% формаліні при кімнатній температурі, зневоднювали градуйованим етанолом і вносили у парафін. Зрізи тканин (товщина 5 мкм) депарафінізували ксилолом і фарбували гематоксиліном та еозином. Імуногістохімічне фарбування проводили з використанням антитіла проти CD3 C7930 (1: 500; Sigma-Aldrich), як описано [27]. Кількість CD3-позитивних гепатоцитів підраховували в 4 випадково відібраних ділянках на кожному зрізі. Печінкове імуногістохімічне фарбування для α-SMA проводили, як описано [17].

2.7. ВЕРХ-аналіз XN у зразках сироватки

Ксантогумол аналізували, як описано раніше [7], з невеликими модифікаціями, щоб дозволити використовувати більші обсяги сироватки через низьку концентрацію аналітів у крові. Коротко, зразки сироватки у двох примірниках доводили до рН 4,5–5,0 за допомогою 6 н. Для запобігання окисленню додавали аскорбінову кислоту (12,5 мкл 10% аскорбінової кислоти у воді; мас./Об.). Сироватку (1,5 мл) інкубували з 25 мкл β-глюкуронідази типу H-1 з Helix pomatia (3 мг/100 мкл в 0,1 М ацетатному буфері, рН 4,5; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Шнельдорф, Німеччина) у темряві при 37 ° C протягом 1 год з легким струшуванням (

100 об/хв). Зразки екстрагували двічі 4 мл етилацетату шляхом змішування протягом 20 хв на вертикальному ротаторі. Зразки центрифугували при 1690 × g протягом 5 хв при 4 ° C між перемішуванням і загалом отримували 7,2 мл супернатанту. Об'єднані супернатанти випаровували насухо при 10 мбар за допомогою відцентрового випарника RVC 2-33 (Martin Christ Gefriertrockungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Німеччина). Висушені залишки розчиняли у 100 мкл метанолу і двічі змішували вихрово, з 10-хвилинним відпочинком при кімнатній температурі між ними, і 10 мкл вводили у ВЕРХ.

Ксантогумол хроматографували на системі ВЕРХ JASCO (LC Net II ADC, AS-2059-SF Plus, PU-2080 Plus, інтелектуальний колонковий термостат CO-2060 Plus, DG-2080-53, LG-2080-02 та детектор фотодіодних решіток PDA MD-2018; JASCO, Гроб-Умштадт, Німеччина), оснащений колонкою Kinetex PFP (Kinetex PFP, розмір пор 100 Å, 250 × 4,6 мм (довжина × діаметр), розмір частинок 5 мкм; Phenomenex), що підтримується при 35 ° C . Рухлива фаза A (деіонізована вода з 5% мурашиної кислоти) та рухлива фаза B (ацетонітрил з 10% деіонізованої води та 5% мурашиної кислоти) подавали зі швидкістю потоку 1,0 мл/хв за методом багатоступеневого градієнта (0 хв 0% B, 1 хв 30% B, 4 хв 30% B, 12 хв 75% B, 14 хв 100% B, 20 хв 30% B). Елюенти контролювали за допомогою детектування фотодіодних решіток при 292 нм зі спектрами, отриманими в діапазоні від 220 до 850 нм. Піки реєстрували та інтегрували за допомогою ChromNav версії 1.19.1 (JASCO) та кількісно визначали, порівнюючи площі піків із автентичними зовнішніми стандартами.