Стабільність доксицикліну в кормі та воді та мінімально ефективні дози в індуцируваних тетрацикліном системах

Ірка М Редельспергер

1 Триінституційна навчальна програма з лабораторної медицини та науки про тварин, Центр раку Меморіал Слоун Кеттерінг, Медичний коледж Вайла Корнелла та Університет Рокфеллера

воді

Тоні Талдон

2 Меморіальний онкологічний центр Слоун Кеттерінг

Елін Р Рідель

2 Меморіальний онкологічний центр Слоун Кеттерінг

Мішель Л Леферд

1 Триінституційна навчальна програма з лабораторної медицини та науки про тварин, Центр раку Меморіал Слоун Кеттерінг, Медичний коледж Вайла Корнелла та Університет Рокфеллера

2 Меморіальний онкологічний центр Слоун Кеттерінг

3 Університет Рокфеллера і

4 Медичний коледж Weill Cornell, Нью-Йорк, Нью-Йорк

Ніл С Ліпман

1 Триінституційна навчальна програма з лабораторної медицини та науки про тварин, Центр раку Меморіал Слоун Кеттерінг, Медичний коледж Вайла Корнелла та Університет Рокфеллера

2 Меморіальний онкологічний центр Слоун Кеттерінг

4 Медичний коледж Weill Cornell, Нью-Йорк, Нью-Йорк

Фелікс Р Вовк

1 Триінституційна навчальна програма з лабораторної медицини та науки про тварин, Центр раку Меморіал Слоун Кеттерінг, Медичний коледж Вайла Корнелла та Університет Рокфеллера

2 Меморіальний онкологічний центр Слоун Кеттерінг

4 Медичний коледж Weill Cornell, Нью-Йорк, Нью-Йорк

Анотація

Залежні від тетрацикліну (тет) регуляторні системи широко використовуються у генетично модифікованих мишей з середини 1990-х років для вивчення функції генів, які неможливо вивчити за допомогою інактивації генів або експресії трансгенів. 18 Ці системи були детально розглянуті. 24, 39, 40 Доксициклін є кращим перед тетрацикліном як індуктором у цих системах завдяки високій потужності доксицикліну, чудовому проникненню в тканини та його широкій доступності. 23, 3 Його зазвичай вводять у корм або питну воду. 39 Незважаючи на широке використання доксициклінових індуцибельних конструкцій, жодної доказової дози доксицикліну для більшості умовних моделей мутантних мишей, що використовуються в даний час, ані стандартів щодо його зберігання та використання не опубліковано.

Деякі джерела повідомляють, що найчастіше застосовувана концентрація доксицикліну у кормах становить 200 ppm на основі сухої речовини. 39, 40 Однак, виходячи з нашого досвіду та концентрацій, зазначених у літературі, 625 ppm використовують принаймні так само часто, якщо не частіше. 31, 37, 41 Високі дози вводять для забезпечення максимальної індукції. Хоча високі дози можуть бути виправданими для розподілу в тканинах з поганим проникненням (наприклад, у мозок) 26, 31, доксициклін може легко проникати та досягати адекватних концентрацій у більшості тканин. 1, 38, 47 Наприклад, доксициклін почав пригнічувати проліферацію клітин та утворення колоній у 2 клітинних лініях ссавців при 0,2 та 20 мкг/мл. 17

Доксициклін має біологічні ефекти, які виходять за межі його антимікробної активності. 15, 33, 46 Цілком ймовірно, що деякі концентрації доксицикліну, які зазвичай використовуються, у поєднанні з тривалістю введення можуть мати непередбачувані біологічні ефекти in vivo. Вживаючи дозу приблизно 15 мг/кг на день протягом 21 дня, доксициклін може інгібувати проліферацію клітин пухлини 15 і дози до 50 мг/кг на день (менша доза, ніж досягнута при використанні 625 проміле в кормі або 2 мг/мл у питній воді) може зменшити розмір аневризм живота у мишей. 33 Ці висновки пояснювали здатністю доксицикліну інгібувати матриксні металопротеїнази. 46

Криві доза-реакція, опубліковані для кількох специфічних мутантів тетрациклінового трансактиватора (tTA, «tet-off»), вказували, що мінімальна ефективна доза для цих конструкцій була значно нижчою (від 20 до 25 мкг/мл у питній воді), ніж в даний час. 10, 22 Для перевірки гіпотези, згідно з якою дози доксицикліну, нижчі за високі дози, що використовуються в даний час (2 мг/мл у питній воді), можуть ефективно запускати тет-індуковані системи, ми використовували 2 різних умовних мутантів миші, кожен з яких має різні промотор та трансактиватор R26-rtTA /TG-Ren.713 та R26-CAGS-rtTA3/TG-Ren.713), щоб визначити мінімальну дозу доксицикліну, необхідну для активації гена. Обидві лінії мутантів включали систему зворотного тетрациклінового трансактиватора (rtTA, "тет-он"), яка є більш поширеною, ніж системи тет-он, і набагато менш чутлива до індукції доксицикліну. 3, 10, 14, 17, 22, 40

На додаток до відмінностей у введеній дозі, спосіб обробки доксицикліну щодо зберігання та заміни сильно варіюється. Хоча різні джерела пропонують замінювати воду, що містить доксициклін, кожні 3 дні, 10, 19, 22, кілька дослідників повідомляють про зміну води кожні 48 годин, 8 та інші замінюють воду щотижня. 29 Зазвичай, часто рекомендується замінювати доксициклінові корми принаймні щотижня. 8 Дослідники часто використовують цю вимогу, щоб виправдати підтримання низького рівня води та бункера для корму, щоб мінімізувати відходи, вимагаючи підвищеної пильності з боку служб догляду за тваринами та слідчого персоналу, щоб забезпечити, щоб тварини завжди мали доступ до достатньої кількості їжі та води. Рекомендації, що базуються на фактичних даних, необхідні для мінімізації витрат їжі та води під час цих експериментів.

Тетрацикліни поглинають UVA-світло і загалом вважаються світлочутливими та нестійкими у воді. 11, 46 Ці характеристики призводять до необхідності розміщувати розчини доксицикліну в захищених від світла (тонованих пляшках) і замінювати воду кожні кілька днів. 3, 39 Одне дослідження показало, що доксициклін залишався стабільним у воді з температурою 37 ° C у тонованих пляшках протягом 1 тижня. 20 Повідомляється, що підкислення води значно покращує стабільність доксицикліну. 27 У світлі цих висновків ми намагалися вивчити стабільність доксицикліну в очищеній зворотним осмосом (RO) воді, яка підкислена або некислена при кімнатній температурі (23 ° C; температура, при якій вода зазвичай подається мишам) 14-денний період. Ми вибрали цей часовий проміжок у світлі нещодавньої тенденції до заміни пляшок з водою кожні 2 тижні в кількох закладах, включаючи наш.

Показано, що доксициклін широко розповсюджений у тканинах після перорального введення у різних видів, 1, 2, 38, і є деякі дані щодо концентрації доксицикліну в плазмі крові після введення мишам у воді, 27 але немає повідомлень про дослідження концентрацій у плазмі крові, коли препарат надається мишам у кормі. Оскільки концентрації доксицикліну в комерційно доступних кормах не були розроблені для досягнення доз, що зазвичай вводяться у воді, чи можна порівняти два способи введення, невідомо. Загалом миші споживають в середньому 4,5 г корму та 6 мл води щодня. 4 Використовуючи цю інформацію, ми спробували забезпечити доксициклін у воді способом, який давав ту саму дозу, що і дози 200- і 625-проміле в кормі, а згодом вимірювали концентрацію доксицикліну в плазмі, досягнуту у мишей.

Матеріали та методи

Тварини.

Використання тварин було затверджено IACUC Меморіального Слоун Кеттерінгового онкологічного центру, де програма догляду та використання тварин має акредитацію AAALAC, і всі тварини утримуються та використовуються відповідно до рекомендацій, наведених у Керівництві. 21

Забір крові.

Кров збирали в один і той же час щодня. Усі зразки крові відбирали у мишей у фіксаторах шляхом пункції вени бічної хвостової вени після нагрівання під тепловою лампою протягом 2 - 5 хв. Максимальний об’єм 100 мкл крові збирали в конічну пробірку, що містить ЕДТА (Microvette 100, Kent Scientific, Torrington, CT).

Корми та вода, що містять доксициклін.

Комерційно доступний, опромінений γ-корм для гризунів, що містить доксициклін, придбаний у 2 виробників (Harlan Teklad, Indianapolis, IN та PMI), був отриманий протягом 30 днів після помелу. Корм, що містить 625 ppm доксицикліну (номер каталогу TD.01306, TestDiet 5053, що містить 625 ppm доксицикліну, PMI), використовували для оцінки стабільності доксицикліну після подрібнення, опромінення, транспортування та зберігання. Корми, що містять 625 ppm (TD.01306) та 200 ppm (TD.00502, Harlan Teklad) доксицикліну, використовувались для оцінки експресії генів та концентрації в плазмі у 2 генно-інженерних індуцибельних штамах мишей.

Для оцінки стабільності доксицикліну у воді ми підготували 500-мл розчини, що містять 2 мг/мл доксицикліну (D9891, Sigma Aldrich, St Louis, MO) та 5% сахарози (S9378, Sigma Aldrich), використовуючи воду RO (pH 6,0 ) або підкисленої HCl води RO (рН 2,7), помістили 450 мл у зелені або нефарбовані, 473 мл, полісульфонові пляшки (Thoren Caging Systems) та проаналізували, як описано. Для досліджень, що оцінювали ефективні дози, до підкисленої води RO додавали різні концентрації доксицикліну та сахарози для досягнення доксицикліну: концентрації сахарози 2 мг/мл: 5%, 467 мкг/мл: 2%, 150 мкг/мл: 1% та 25 мкг/мл: 0,23%.

Визначення концентрації доксицикліну.

Гранули подрібнювали індивідуально в кавомолці (Fresh Grind, Hamilton Beach, Southern Pines, NC). Приблизно 25 мг меленої гранули поміщали в 15-мл пробірку; Додавали 0,5 мл суміші 75% води + 25% ацетонітрилу + 0,1% мурашиної кислоти, і суміш вихровували протягом 5 хв, а потім обробляли ультразвуком ще 40 хв. Пробірку центрифугували протягом 5 хв при 180 х г супернатанту переносили в нову 15-мл пробірку, а частину фільтрували (0,45 мкм; Sun SRI, Rockwood, TN) в іншу пробірку. Аліквоту 50 мкл переносили в лунку 96-лункового планшета для аналізу методом ВЕРХ – тандемної мас-спектрометрії (LC-MS/MS).

Плазма.

Плазму (50 мкл) додавали до 1,5-мл пробірки для мікроцентрифуги (Eppendorf Safe-Lock, USA Scientific, Ocala, FL), а потім 250 мкл ацетонітрилу. Зразок перемішували на вортексі протягом приблизно 45 с, центрифугували протягом 5 хв при 19 445 х г і супернатант переносили в іншу пробірку для мікроцентрифуги. Зразок випарювали на відцентровому випарнику (GeneVac, Stone Ridge, NJ), а залишок розчиняли в 100 мкл розчинника (75% H2O + 25% ацетонітрилу + 0,1% мурашиної кислоти). Розчин перемішували на вортексі протягом приблизно 15 с і центрифугували протягом 5 хв при 19 445 х г; 50 мкл супернатанту переносили в лунку 96-лункового планшета для аналізу за допомогою LC-MS/MS.

Вода.

Кожну пробу води (50 мкл) додавали до 950 мкл суміші 75% води + 25% ацетонітрилу + 0,1% мурашиної кислоти (розчинника) в пробірці для мікрофугування та вихрово перемішували протягом 10 с; 20 мкл цієї суміші додавали до 980 мкл розчинника і перемішували на вортексі протягом 10 секунд; 50 мкл кінцевої суміші переносили в лунку 96-лункового планшета для аналізу за допомогою LC-MS/MS.

Доксицикліновий аналіз.

Концентрації доксицикліну в кормі, воді та плазмі визначали за допомогою LC-MS/MS (модель 6410 LC-MS/MS система, Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія). Аналіз базувався на доксицикліні (а не на їхній гіклатній солі; 1 мг доксицикліну еквівалентно 1,154 мг гідклату доксицикліну). Аналіз проводили в режимі багатореакційного моніторингу з використанням іонізації електророзпилюванням з позитивними іонами. Поділ ВЕРХ проводили на колонці розміром 4,6 мм × 50 мм, 5 мкм (колонка Zorbax Eclipse XDB-C18, Agilent Technologies), і аналіту елюювали в ізократичних умовах (75% H2O + 0,1% HCOOH: 25% CH3CN) 5 хв при швидкості потоку 0,5 мл/хв. Стандарти доксицикліну гіклату використовували для формування стандартної кривої з межею виявлення 50 пг/мл для всіх типів відібраних зразків.

Проточна цитометрія.

План експерименту.

Стійкість доксицикліну у воді.

Для оцінки того, наскільки умови освітлення приміщення (750 ± 110 lx під час увімкненого освітлення; 12: 12-годинний світло: темний цикл) впливають на доксициклін у пляшках з водою в клітинах для мишей, зразки відбирали з полісульфонових пляшок із зеленим тоном та стандартних, нефарбованих полісульфонові пляшки (Thoren Caging Systems). На 0-й день воду, що містить доксициклін, готували, використовуючи або RO, або підкислену RO-воду, як описано. Кожен розчин був розділений на 3 тоновані та 3 нефарбовані пляшки. З кожної пляшки відбирали 1 мл зразка перед поміщенням у клітку. Після цього зразки води об'ємом 1 мл збирали з кожної пляшки через 7 і 14 днів після розміщення або раніше (якщо вода стала непридатною для споживання; наприклад, наявність цвілі або осадів). Зразки води зберігали при –80 ° C до аналізу.

Стійкість доксицикліну в кормах під час подрібнення та після зберігання.