Сприйнятливість різних штамів дикого типу мишей до розвитку печінкової хвороби NAFLD/AFLD, пов’язаної з дієтою

Філія BioPersMed/Biobank Graz, Медичний університет Граца, Грац, Австрія

Афілійований відділ фармації, фармацевтична біологія, Університет Саар, Саарбрюккен, Німеччина

Відділ фармацевтики, фармацевтична біотехнологія, Університет Саар, Саарбрюккен, Німеччина, Департамент мікробних природних продуктів, Інститут фармацевтичних досліджень Саарля (HIPS), Центр досліджень інфекції та фармацевтичної біотехнології Гельмгольца (HZI), Саарбрюккен, Німеччина

Відділ фармацевтики, фармацевтична біотехнологія, Університет Саар, Саарбрюккен, Німеччина, Департамент мікробних природних продуктів, Інститут фармацевтичних досліджень Саарля (HIPS), Центр досліджень інфекцій та фармацевтичної біотехнології Гельмгольца (HZI), Саарбрюккен, Німеччина

Афілійований відділ фармації, фармацевтична біологія, Університет Саар, Саарбрюккен, Німеччина

Партнерський інститут біомедицини та наук про здоров'я, Joanneum Research, Грац, Австрія

Партнерський інститут патології, Медичний університет Граца, Грац, Австрія

Філія BioPersMed/Biobank Graz, Медичний університет Граца, Грац, Австрія

Віра Х. І. Фенглер,
Таня Мачейнер,
Соня М. Кесслер,
Беате Чепукойц,
Катя Гемперлейн,
Рольф Мюллер,
Олександра К. Кімер,
Крістоф Магнес,
Йоганнес Хейбек,
Каролін Лакнер

Цифри

Анотація

Цитування: Fengler VHI, Macheiner T, Kessler SM, Czepukojc B, Gemperlein K, Müller R, et al. (2016) Сприйнятливість різних штамів дикого типу миші до розвитку печінкової хвороби, спричиненої дієтою NAFLD/AFLD. PLoS ONE 11 (5): e0155163. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155163

Редактор: Павло Стрнад, RWTH Ахен, НІМЕЧЧИНА

Отримано: 5 лютого 2016 р .; Прийнято: 25 квітня 2016 р .; Опубліковано: 11 травня 2016 р

Наявність даних: Усі відповідні дані знаходяться в газеті та в допоміжних файлах.

Фінансування: Цю роботу підтримав BioPersMed [COMET K-проект 825329], який фінансувався Федеральним міністерством транспорту, інновацій та технологій (BMVIT), Федеральним міністерством економіки та праці, Федеральним міністерством економіки, сім'ї та молоді (BMWA)/BMWFJ), а також Агенцією просування бізнесу в Штирії (SFG) (VHIF та KS) та Федеральним міністерством освіти та досліджень за номером проекту [O1KU1216F] (AKK). Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Традиційно для моделювання індукованих дієтою NAFLD та AFLD чоловічих штам C57BL/6 CD-1 та 129Sv WT є найбільш часто використовуваними штамами [26–28, 30, 34, 47]. Таким чином, гендерні та генетичні детермінанти мишей можуть впливати на їх сприйнятливість до розвитку NAFLD/AFLD. Повідомлялося про гендерно-специфічні відмінності у розвитку НАЖХП у мишей. Чоловічі гризуни виявляють підвищену сприйнятливість до розвитку НАЖХП, що протиставляється спостереженням у людей, де, здається, у жінок більша поширеність НАЖХП [9, 49–51]. Відомі генетичні детермінанти мишей C57/BL/6, що впливають на розвиток NAFLD, включають експресію та активність стеароїл-коферменту А десатурази 1 (SCD-1), що зв’язує білок-1c (SREBP-1) із вищим стеролом [27]. Крім того, миші C57BL/6, схоже, більш схильні до фенотипу, подібного до NAFLD, завдяки механізмам, що включають активацію макрофагів [52].

Матеріали та методи

Миші та дієти

Протокол для тварин (BMWF-66.010/0081-II/3b/2012) затверджений Комітетом захисту тварин Медичного університету в Граці та Федеральним міністерством науки та досліджень Австрії. II/3б. Розміщення мишей проводилося з їжею та водою ad libitum і контролювалось відповідно до Політики щодо захисту тварин Медичного університету Граца.

Самці мишей C57BL/6N (C57BL/6), 129S2/Sv (129Sv) та CD-1 (лабораторії Чарльз-Рівер, Німеччина) утримувались у групі в індивідуально провітрюваних клітках у спеціальному приміщенні, вільному від патогенів (SPF), протягом 12 годин. світловий і темний цикл. Після періоду акліматизації мишей віком від 8 до 10 тижнів підбирали за вагою та розподіляли на чотири групи (n = 5). Перша група отримувала рідку дієту Lieber DeCarli з високим вмістом жиру (HF) (46,23% жиру: 28,17% кукурудзяної олії, 16,49% оливкової олії, 1,57% олії сафлору) (Ssniff, Німеччина). Другу групу обробляли етанолом, годуючи рідкою дієтою Лібера ДеКарлі (EtOH), а третя група отримувала рідку дієту Лібера ДеКарлі з високим вмістом жиру, доповнену етанолом (HF + EtOH) [25]. Мишей пристосовували до рідкої дієти, перш ніж концентрацію етанолу збільшували на 1% кожен третій день до остаточно 5% для EtOH та 2,5% для HF + EtOH. Миші отримували HF протягом 7 тижнів, EtOH - через 12, 14 та 16 тижнів, а HF + EtOH - відповідно 5, 7 та 9 тижнів. Четверта група була принесена в жертву після періоду акліматизації і служила необробленою групою. Для збору зразків тканини та крові мишам знеболювали інгаляцією ізофлурану та обезголовлювали. Зразки тканин швидко заморожували і зберігали в рідкому азоті. Додаткову аліквоту печінки фіксували у 10% формаліні.

Біохімічний аналіз показників сироватки крові

Сироватку збирали центрифугуванням (5000 г, 15 хв, кімнатна температура). Аспартатамінотрансфераза (AST), аланінамінотрансфераза (ALT), сироватковий TG, холестерин у сироватці крові (Roche Diagnostics, Швейцарія) та вільні жирні кислоти у сироватці крові (FFA) (Wako Chemicals GmbH, Японія) визначали за допомогою комерційних наборів для аналізів відповідно до інструкцій виробника.

Гістологічний аналіз

Після фіксації формаліну печінку вкладали в парафін і розрізали на 3 мкм. Всі зрізи фарбували гематоксиліном та еозином (ВІН) для мікроскопічного дослідження, яке проводили два сертифіковані патологоанатоми (J.H., C.L.) у сліпому дослідженні. Крім того, заморожені зразки печінки розділяли на 6 мкм і фарбували Олійним червоним О для ілюстрації накопичення печінкових ліпідів.

Для кількісної оцінки печінкових ефектів, спричинених різними дієтичними режимами, оцінювали стеатоз, запалення та фіброз, аналогічно оцінці активності NAFLD (NAS) від NASH-CRN [10].

Імуноаналіз показників запалення печінки

Кріоконсервовані зразки печінки гомогенізували, супернатанти двічі центрифугували (16000 г, 10 хв, 4 ° C), а потім вимірювали загальну концентрацію білка за допомогою набору для аналізу білка DC (Bio-Rad, США). Вміст інтерлейкіну 6 (IL-6), фактора некрозу пухлини α (TNFα) та вмісту білка-хіміотрактанта білка-1 (MCP-1) печінкових моноцитів вимірювали за допомогою імунологічного дослідження ProcartaPlex TM (eBioscience, США) відповідно до інструкцій виробника. Таким чином, супернатанти гомогенатів печінки розводили до загальної концентрації білка 10 мг/мл і 25 мкл цього розведення використовували для вимірювань.

Аналіз класів ліпідів

Екстракцію ліпідів та аналіз тонкошарової хроматографії (ТШХ) проводили, як описано раніше, використовуючи суміш сірчаної кислоти/етанолу для виявлення [54]. Коротше кажучи, 15 мг ліофілізованої тканини диспергували у гексані/2-пропанолі [3: 2 (об./Об.)] Протягом 10 хв і центрифугували при 4 ° С, 10 000 г протягом 10 хв. Висушений потоком азоту супернатант розчиняли в хлороформі/метанолі [1: 1 (об./Об.)] І наносили на пластини ТШХ, які попередньо промивали сумішшю хлороформ/метанол [2: 1 (об./Об.)] І активується при 110 ° C протягом 1 год. Пластини ТШХ, завантажені зразками та стандартними речовинами, спочатку розробляли до середини планшетів у хлороформі/метанолі/оцтовій кислоті/воді [50: 30: 8: 3 (об./Об./Об.)], А потім повністю розробляли в гептан/діетиловий ефір/оцтова кислота [70: 30: 2 (об./об.)]. Щільність площі співвідношення кожної смуги визначали кількісно за допомогою програмного забезпечення ImageJ.

Аналіз профілю жирних кислот методом GC-MS

Холестерин та жирні кислоти (FA) заморожених та ліофілізованих зразків тканин печінки екстрагували методом метилового ефіру жирних кислот (FAME) та вимірювали за допомогою GC-MS, як було опубліковано раніше [55].

Статистичний аналіз

Усі результати виражаються як медіани з інтерквартильним діапазоном, якщо не зазначено інше. Для аналізу даних використовувались Крускал-Уолліс, а потім тест Данса вибраних пар колон або тест Манна-Уітні U. Відмінності вважали значущими для значень Р на рис. 1. Збільшення ваги та відношення жиру до маси тіла різних дієтичних груп та штамів миші.

(A-C) Збільшення ваги HF, EtOH та HF + EtOH груп та різних штамів мишей контролювали двічі на тиждень, що призводило до індукованого схемою збільшення маси C57BL/6 та CD-1, але не у мишей 129Sv. (DF) Співвідношення маси жиру до маси тіла відповідних штамів та дієтичних груп, що свідчить про збільшення підшкірного, а також загального співвідношення жиру до маси тіла у мишей C57BL/6 та 129Sv, тоді як миші CD-1 демонстрували лише незначні зміни через HF, EtOH, і живлення HF + EtOH. В кінці кожного експерименту розчиняли підшкірну, а також вісцеральну жирову тканину, розраховували зважені та підшкірні жирові, вісцеральні жирові та загальні співвідношення жиру та маси тіла. Показані медіани з інтерквартильними діапазонами, а відповідні суттєві відмінності позначені зірочкою (Крускал-Уолліс з подальшим тестом Данса відібраних пар колон, значення P на рис. 2. Сироваткові рівні TG, загальний холестерин, FFA та функції печінки, трансамінази AST і ALT всіх груп схем мишей C57BL/6, CD-1 та 129Sv.

(AE) Метаболічні параметри сироватки та рівні трансаміназ мишей C57BL/6 продемонстрували значне збільшення загального рівня холестерину в сироватці крові HF, EtOH 14 тижнів та HF + EtOH 9 тижнів, що годували мишей, і зниження TG сироватки у мишей, яких годували EtOH протягом 12 тижнів порівняно з необробленими мишами. (F-J) Зміни метаболічних та печінкових показників у сироватці мишей CD-1, які отримували схему лікування, призвели до значного підвищення загального рівня холестерину у мишей, яких годували HF та EtOH протягом 14 тижнів, порівняно з нелікованими аналогами. (K-O) Сироваткові концентрації метаболічних та печінкових показників у мишей 129Sv показали підвищений рівень холестерину у групі HF та підвищений рівень AST у HF та EtOH мишах, яких годували 16 тижнів, порівняно з необробленою групою. Наведені медіани з інтерквартильними діапазонами, а відповідні суттєві відмінності позначені зірочкою (Крускаль-Уолліс, а потім тест Данса відібраних пар колон, значення P на рис. 3. Гістологія печінки, візуалізована за допомогою фарбування ВІН та олійного червоного O, а також кількісна оцінка NAS захворювань печінки, спричинених дієтою.

Гістопатологічне дослідження печінки C57BL/6 виявило мікровезикулярний та легкий макровезикулярний стеатоз у мишей, яких годували HF та HF + EtOH. Клітини, що нагадують повітряні кулі, спостерігали при ВЧ-годуванні та додатково у печінці мишей C57BL/6, яких годували HF + EtOH протягом 9 тижнів, і обидві дієтичні групи демонстрували значно вищий NAS у порівнянні з необробленою групою. Групи, що годували EtOH, виявляли підвищений стеатоз та запалення, але відсутність повітряних куль (рис. 3 та таблиця 1).

У мишей CD-1 дієтичні режими мали незначні особливості НАЖХП/АФЛД, оскільки стеатозу майже не спостерігалось. Повітряна куля також не відбувалась, а запальні клітини були рідкістю. Порівняно з необробленою групою, NAS було значно збільшено лише в групі, яка годувалась EtOH протягом 16 тижнів, тоді як це було головним чином через збільшення запалення (рис. 3 та таблиця 1).

На відміну від цього, у печінки 129Sv спостерігався помірний стеатоз, присутній майже у всіх печінках, отриманих з трьох різних дієтичних груп. Однак аеростатування не було показано ні в одній печінці мишей 129Sv. Запальна клітинна інфільтрація помітно відзначалась у групах, що годували EtOH та HF + EtOH, і зростала від найкоротшої до найдовшої тривалості годування (рис. 3 та таблиця 1).

Крім того, ні в однієї з нелікованих або лікуваних схемою мишей не спостерігався фіброз будь-якого штаму.

Статистична кореляція NAS та режимів харчування у порівнянні з мишами C57BL/6, CD-1 та 129Sv наведена у таблиці S1 (таблиця S1).

Запальна реакція у печінці мишей з високим вмістом жиру та етанолом

Для кількісної оцінки запалення в печінці мишей, які отримували дієтичний режим, у тканинах печінки вимірювали інтерлейкін-6 (IL-6), фактор некрозу пухлини альфа (TNFα) та хемоаттрактантний білок моноцитів (MCP-1), результати показані на рис.4 Рівень IL-6 у нелікованих мишей C57BL/6 був щонайменше в 1,3 рази вищий, ніж у мишей різних дієтичних груп, що узгоджується з попередніми повідомленнями, в яких підвищений рівень печінкового IL-6 відповідав здоровій печінці, на відміну від підвищений системний ІЛ-6, який асоціюється з НАЖХП/АФЛД [48, 56–58]. 7 тижнів годування HF та HF + EtOH значно знижували рівень IL-6 мишей C57BL/6 порівняно з необробленими мишами (Фіг. 4А). TNFα відіграє ключову роль у розвитку стеатогепатиту, посилюючи фіброз [57, 58], і печінковий TNFα значно збільшувався у EtOH, що годували мишей C57BL/6, порівняно з необробленими мишами (рис. 4А). MCP-1 важливий для набору моноцитів/макрофагів у печінці та, як вважають, ініціює запалення при NAFDL/AFLD [32, 59]. Годування EtOH протягом 14 тижнів підвищувало печінковий MCP-1 у мишей C57BL/6 значно порівняно з відсутністю лікування (рис. 4А).

Маркери запалення визначали з гомогенатів печінки всіх печінок відповідних штамів мишей та дієтичних груп. Рівні IL-6, TNFα та MCP-1 мишей (A) C57BL/6, мишей (B) CD-1 та мишей (C) 129Sv, що вказує на запальну реакцію у мишей C57BL/6 та 129Sv за рахунок зниження печінкового IL- 6 та підвищені концентрації TNFα та MCP-1 у печінці завдяки режиму годування. Наведені медіани з інтерквартильними діапазонами, а відповідні суттєві відмінності позначені зірочкою (Крускал-Уолліс, а потім тест Данса відібраних пар колон, значення Р на рис. 5. Визначення ліпідного профілю печінки у мишей, оброблених мишами CD-1 та 129Sv.

Вміст печінкових ліпідів визначали у печінці за режимами, що годували мишей CD-1 та 129Sv напівкількісним хроматографічним методом, і відображали як відносну кількість порівняно з необробленими аналогами. (A) Рівні TG були підвищені в обох штамах мишей, при збільшеному зберіганні печінкового TG у мишей 129Sv порівняно з мишами CD-1. (B) Вільний холестерин був змінений лише в деяких режимах лікування мишей 129Sv, включаючи зниження вільного холестерину в групі, яка годувала групу EtOH 14 тижнів, і збільшення вільного холестерину в HF + EtOH, що годували протягом 7 та 9 тижнів. Рівні (C) CE, а також (D) CER були підвищені у всіх групах годування будь-якого штаму, з більшим вмістом CE у мишей 129Sv порівняно з мишами CD-1. (E) Рівні ПК не змінювались у мишей CD-1, тоді як HF годування протягом 7 тижнів спричиняло підвищений вміст ПК, а годування HF + EtOH протягом 7 тижнів спричиняло зниження рівня PC. (F) Вміст РЕ був однаковим у обох штамів, без змін у мишей, що не отримували лікування та не отримували схему лікування. Значення наведені як засоби із стандартними відхиленнями, а відповідні суттєві відмінності позначені зірочкою (U-тест Манна-Уітні, значення P на рис. 6. Склад FA схеми лікування, обробленої печінкою мишей 129Sv.