Потенційні інгібітори ліпази з китайських лікарських трав

Стаття дослідження

Повна стаття
Цифри та дані
Список літератури
Цитати
Метрики
Передруки та дозволи
PDF

Анотація

Контекст: Ожиріння стало основною проблемою охорони здоров'я, і воно завдає як особистого, так і економічного тягаря населенню світу. Традиційні китайські лікарські трави є багатим джерелом сполук свинцю і є можливими лікарськими засобами, які можуть бути використані для лікування цього стану.

Завдання: У цьому дослідженні проведені скринінгові потужні інгібітори панкреатичної ліпази, виявлені в традиційних китайських лікарських травах, для лікування ожиріння.

Матеріали та методи: Було встановлено аналіз інгібування ліпази свинячої підшлункової залози, а інгібуючу активність 35 традиційних китайських лікарських трав оцінювали при концентрації 200 мкг/мл. Дві елюції рослинних екстрактів із сильною інгібуючою активністю ліпази були додатково фракціоновані за допомогою препаративної високоефективної рідинної хроматографії на 22 підфракції кожна, і ці субфракції тестували на антиліпазну активність. Підфракції, які виявляли сильну інгібуючу активність ліпазу, постійно фракціонували на окремі сполуки. Дві активні сполуки з сильною антиліпазною активністю були остаточно виділені та ідентифіковані з двох традиційних китайських лікарських трав відповідно.

Результати: Серед 35 традиційних китайських лікарських трав 95% етанолові елюції Panax notoginseng (Берк.) Ф.Х.Чень (Аралієві) і Магнолія лікарська Rehd. et Wils (Магнолії) виявляв сильну антиліпазну активність. Два з'єднання, у тому числі 20 (S) -гінзенозид Rg3 та хонокіол були ідентифіковані за допомогою ізоляції, керованої біоактивністю, з IC50 = 33,7 та 59,4 мкг/мл відповідно.

Висновок: 20 (S) -гінзенозид Rg3 та хонокіол можуть бути придатними кандидатами для лікування ожиріння.

Вступ

Ожиріння стало серйозною проблемою охорони здоров'я у всьому світі (Stevens et al. 2012). Ожиріння не тільки спричиняє захворювання та інші хворобливі стани, такі як гіперліпідемія, гіпертонія, артеріосклероз, інсуліннезалежний цукровий діабет та ішемічна хвороба серця (Jung 1997; Kopelman 2000), але також створює величезне економічне навантаження на людей та суспільство. У 2005 році близько 190 мільярдів було витрачено на медичне обслуговування, пов’язане з ожирінням, лише в США (Lehnert et al., 2013). Витрати на медицину різко зросли і можуть продовжувати зростати (Wang et al. 2008; Mora et al. 2015). На додаток до цих прямих витрат ожиріння також спричиняє втрату продуктивності (Trogdon et al. 2008). Дослідження та розробка нових препаратів проти ожиріння нещодавно привернули увагу як фармацевтичної промисловості, так і науково-дослідних центрів.

Ожиріння передбачає накопичення надмірної кількості жиру в організмі (Hill et al. 2000). Випробовуваних годували дієтами з високим вмістом жиру та триацилгліцеринами з тих жирів, що розкладаються ліпазою та поглинаються клітинами кишечника (Shi & Burn 2004). У процесі травлення ліпаза підшлункової залози є ключовим ферментом, що перетравлює ліпіди (Hadvary et al. 1988). Інгібування ліпази підшлункової залози є одним із методів профілактики та лікування ожиріння (Birari & Bhutani 2007). Наприклад, один інгібітор панкреатичної ліпази, орлістат, був схвалений Управлінням з контролю за продуктами та ліками США в 1999 році для лікування ожиріння (Leung et al. 2003). Хоча препарат має значний ефект проти ожиріння, він також спричинює незначні побічні ефекти з боку шлунково-кишкового тракту (Cheung et al. 2013). Важливо знайти та розробити більше інгібіторів панкреатичної ліпази, які є безпечними та ефективними та не поділяють недоліків орлістату.

Натуральні продукти з традиційних лікарських рослин та мікробні джерела визнані важливим джерелом нових ліків (Molinari 2009). Близько 50% схвалених препаратів отримують із природних продуктів (Newman & Cragg 2007). В останні роки було виявлено, що природні продукти виявляють багатообіцяючу активність щодо інгібування ліпази підшлункової залози (Birari & Bhutani 2007; de la Garza et al. 2011). Це зацікавило велику кількість дослідників (Kim & Kang 2005; Sharma et al. 2005; Slanc et al. 2009; Zheng et al. 2010; Ramirez et al. 2012; Roh & Jung 2012). Їхні зусилля, ймовірно, допоможуть виявити та розробити потужні інгібітори підшлункової залози з традиційних китайських лікарських трав, життєздатною альтернативною стратегією для безпечного та ефективного виявлення ліків проти ожиріння (de la Garza et al. 2011).

У цьому дослідженні було відібрано 35 традиційних китайських лікарських трав, які виявляли перспективну інгібуючу активність проти ожиріння, гіперліпідемії або як під час молекулярного докінгового аналізу, так і під час видобутку літератури для виявлення нових сполук свинцю та інгібіторів панкреатичної ліпази шляхом ізоляції, керованої біопробами.

Матеріали та методи

Рослинні матеріали та хімікати

Всі трави були поставлені аптекою Канджі з травня по червень 2013 року та визначені д-ром Чженчжун Вангом (Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd.). Колекція зразків ваучерів доступна для підтвердження в дослідницькому центрі Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd. (Ляньюньган, Китай, Китай). Свиняча панкреатична ліпаза (PPL) типу VI-S та стор-нітрофенілпальмітат (PNP) були придбані у Sigma Chemical (Шанхай, Китай). 20 (S) -Гінзенозид Rg3 та хонокіол були отримані від Національного інституту контролю за харчовими продуктами та ліками (Пекін, Китай). Ацетонітрил високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) був наданий компанією Tedia (Аньхой, Китай). Усі інші хімічні речовини та розчинники були аналітичного класу.

Підготовка зразків

Всі трави сушили на повітрі і подрібнювали у дрібний порошок. Порошки (50 г) екстрагували дистильованою водою (10-кратний об'єм на масу) із зворотним холодильником двічі, кожні 2 години. Після фільтрування водний екстракт адсорбували на макропористій смолі HP-20 (100 мл) (Diaion HP-20, Mitsubishi Chemical Ind. Ltd., Токіо, Японія). Потім колонку HP-20 промивали послідовно H2O (400 мл), 20% етанолом (400 мл), 40% етанолом (400 мл), 95% етанолом (400 мл). Потім розчини сушили на роторному вакуумному випарнику при 50 ° С. Зразки зберігали в сухих умовах для подальших досліджень.

95% -не елюювання етанолом Магнолія лікарська Rehd. et Wils (Magnoliaceae) та Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen (Araliaceae) фракціонували за допомогою препаративної ВЕРХ (Agilent 1260, оснащений детектором багаторівневої хвилі та колоною Fuji-C-18). Рухлива фаза складалася з води (А) та ацетонітрилу (В) зі швидкістю потоку 30 мл/хв: 20–30% В через 0–20 хв; 30–45% В через 20–40 хв; 45–90% B через 40–55 хв; 90–100% B через 55–60 хв; 100% B через 60–70 хв. Довжину хвилі виявлення встановили на рівні 210 нм. Підфракції збирали кожні 3 хв і концентрували дистиляцією при зниженому тиску. Потім субфракції ліофілізували і зберігали при кімнатній температурі.

Аналіз інгібування PPL

Активність ліпази вимірювали, використовуючи PNP як субстрат (Winkler & Stuckmann 1979; Lee et al. 1993). Вихідний розчин PPL (1,2 мг/мл) готували в 50 мМ буфері Tris-HCl рН 8,0 (у поєднанні з 0,2% дезоксихолатом натрію та 0,1% аравійської гумі). Цю суміш аликвотно розподіляли і зберігали при -70 ° C. PNP розчиняли в ізопропанолі у вихідному розчині 25 мМ і зберігали при 4 ° C. Для визначення інгібуючої активності щодо ліпази зразки та сполуки попередньо інкубували з ферментом (5 мкг/мл) протягом 10 хв у буфері Tris-HCl при 37 ° C. Потім реакцію розпочинали додаванням 0,1 мл PNP (0,5 мМ). Кінцевий об’єм становив 0,2 мл. Після інкубації при 37 ° С протягом 60 хв, поглинання при 405 нм вимірювали за допомогою мікропланшетного зчитувача (Molecular Devices, Саннівейл, Каліфорнія).

Швидкість інгібування розраховували за такою формулою (Zheng et al. 2010):

Тут A - активність за відсутності інгібітора; a - негативний контроль за відсутності інгібітора; B - активність у присутності інгібітора; і b - негативний контроль у присутності інгібітора.

Аналіз ВЕРХ (LC-DAD/Q-TOF/MS)

Використовували ВЕРХ Agilent 1290 (Санта-Клара, Каліфорнія), оснащену діодним детектором решітки та якісним мас-спектрометром Time-of-Flight 6538. Хроматографічне розділення проводили на колонці Phenomenex Luna C18 (Торранс, Каліфорнія) для 19-ї підфракції Магнолія лікарська (MO-19) та 17-та підфракція Panax notoginseng (PN-17). Рухлива фаза складалася з води (А) та ацетонітрилу (В). Градієнтне елюювання проводили наступним чином: 0–25 хв, 30–35% В; 25–55 хв, 35–50% В; 55–80 хв, 50–90% B при швидкості потоку 1 мл/хв для MO-19; 0–30 хв, 35–50% В; 30–35 хв, 50% В; і 35–50 хв, 50–90% B при швидкості потоку 1 мл/хв для PN-17. Довжини хвилі детектування встановлювали на 230 та 210 нм для MO-19 та PN-17 відповідно. Для виявлення РС параметри були встановлені наступним чином: температура колонки в печі, 30 ° C; газ зіткнення, гелій надвисокої чистоти; інгаляційний газ, азот високої чистоти; капілярна напруга, 4000 В; швидкість потоку сушильного газу, 10 л/хв; температура газу, 350 ° С; тиск небулайзера, 50 psi; напруга скімера, 65 В; і напруга фрагментатора - 100 В. Діапазон мас був встановлений м/з 100–3200 Да. Кожну пробу аналізували в позитивних режимах для визначення її структури.

Статистичний аналіз

Усі результати виражаються як середнє значення ± стандартне відхилення (n = 3). Значимість відмінностей від контролю визначали за допомогою критерію Дункана та критерію Крускала – Уолліса та стор Потенційні інгібітори ліпази з китайських лікарських трав

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця 1. Інгібуюча активність PPL різних китайських лікарських трав.

Антиліпазна активність підфракцій з Panax notoginseng і Магнолія лікарська

І те, і інше Panax notoginseng і Магнолія лікарська виявляв сильну антиліпазну активність. Двадцять дві субфракції з 95% -ного елюювання етанолом Panax notoginseng і Магнолія лікарська потім готували з використанням препаративної ВЕРХ. Інгібуючу активність підфракцій досліджували на ліпазі підшлункової залози. Як показано на малюнку 1, PN-17 від Panax notoginseng виявляв найсильнішу антиліпазну активність із цих 22 підфракцій та MO-19 з Магнолія лікарська показав найпотужнішу антиліпазну активність із 22 підфракцій.

Опубліковано в Інтернеті:

Малюнок 1. Інгібуюча активність PPL 22 підфракцій з Panax notoginseng і Магнолія лікарська. Три вимірювання проводили на підфракцію. Дані були виражені як середнє ± стандартне відхилення (n = 3). Кінцева концентрація субфракцій становила 200 мкг/мл.

Ідентифікація активних сполук

PN-17 та MO-19 були розділені LC-DAD/Q-TOF/MS (рис. 2 (а) та 3 (а)). Порівнювали час утримання еталонних речовин, три піки PN-17 приписували гінзенозиду Rh4, 20 (S) -гінзенозид Rg3 та 20 (Р.) -гінзенозид Rg3 (Yao et al. 2011; Kim et al. 2013), а єдиним піком MO-19 був віднесений хонокіол (Lee et al. 2011). Потім їх ідентичність підтвердили мас-спектрометрією (табл. 2). Результат аналізу активності сполук надалі припускав, що другий пік мав найсильніший антиліпазний ефект із трьох піків PN-17 (рис. 2 (b)). Крива доза-реакція 20 (S) -гінзенозид Rg3 та хонокіол виявили, що ці два сполуки є сильними інгібіторами ліпази підшлункової залози (рис. 2 (в) та 3 (в)).

Опубліковано в Інтернеті:

Фігура 2. Інгібуюча активність PPL 20 (S) -гінзенозиду Rg3. (a) Хроматограми (A) еталонної речовини 20 (S) -гінзенозиду Rg3, (B) підфракції суміші PN-17, включаючи (1) гінзенозид Rh4, (2) 20 (S) -гінзенозид Rg3, (3) 20 (Р.) -гінзенозид Rg3 при 210 нм. (b) Інгібуюча активність PPL трьох складних компонентів PN-17. Кінцева концентрація трьох складових компонентів становила 50 мкг/мл. (c) Інгібування PPL від концентрації, що залежить від 20 (S) -гінзенозиду Rg3. Швидкість інгібування була побудована на основі журналу сукупних доз 20 (S) -гінзенозид Rg3 (Середнє значення ± SD, n = 3).

Опубліковано в Інтернеті:

Фігура 3. Інгібуюча активність PPL хонокіолу. (а) Хроматограми (А) еталонної речовини хонокіол, (В) підфракції МО-19 при 230 нм. (b) Структура хонокіолу. (c) Інгібування PPL хонокіолом від концентрації. Швидкість інгібування була побудована на основі журналу сукупних доз хонокіолу (середнє значення ± SD, n = 3).

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця 2. Аналіз маси ESI PN-17-2 і MO-19.

Обговорення

Натуральні продукти дуже різноманітні за хімічною структурою та біологічною активністю. Вони були важливим джерелом сполук свинцю для відкриття ліків (Xie et al. 2012; Tsai et al. 2013; Deng et al. 2014; Zhou et al. 2014). Метою цього дослідження було виявлення потенційних інгібіторів панкреатичної ліпази, отриманих із традиційних китайських лікарських трав, на користь для лікування проти ожиріння. У цьому дослідженні 35 трав було вилучено та елюйовано 20%, 40% та 95% етанолом. Потім оцінювали їх антиліпазну активність в пробірці. 95% етанолові елюції Panax notoginseng і Магнолія лікарська виявляв сильну антиліпазну активність, тому їх далі фракціонували на 22 підфракції кожна. Встановлено, що PN-17 та MO-19 мають найпотужніші антиліпазні ефекти. Тоді 20 (S) -гінзенозид Rg3 та хонокіол були виявлені у PN-17 та MO-19 відповідно.

Магнолія лікарська повідомляється, що він містить кілька біоактивних компонентів, включаючи магнолол, хонокіол, 4-О-метилхонокіол та обоватол (Lee et al. 2011). Нещодавнє дослідження показало, що Магнолія лікарська екстракт та його активний компонент, 4-О-метилхонокіол, може захистити мишей від ожиріння, спричиненого дієтою, підвищеним обміном ліпідів (Zhang et al. 2014). Результати поточного дослідження показали, що розумно, що хонокіол, інгібітор ліпази, може бути компонентом проти ожиріння Магнолія лікарська.

Звіти показали, що сапоніни від Platycodi radix, Acanthopanax senticosus і Panax japonicus може інгібувати ліпазу підшлункової залози та покращувати збільшення маси тіла, спричинене дієтами з високим вмістом жиру у мишей (Han et al. 2002; Han et al. 2005; Li et al. 2007). Попереднє дослідження передбачало, що 20 (S) -гінзенозид Rg3 може інгібувати накопичення ліпідів під час диференціювання адипоцитів 3T3-L1 за допомогою сигнальних шляхів AMPK та PPAR-γ (Hwang et al. 2009). Поточне дослідження показало 20 (S) -гінсенозид Rg3, щоб бути активним компонентом Panax notoginseng проти ліпази підшлункової залози. Взяті разом, 20 (S) -гінзенозид Rg3 може бути придатною сполукою свинцю для лікування ожиріння, і він діє за рахунок зменшення всмоктування та накопичення ліпідів (Cicero et al. 2003; Kim & Park 2003).

Дві основні, цінні сполуки, 20 (S), виявлено, що гінгінозид Rg3 та хонокіол мають антиліпазну дію шляхом ізоляції, керованої біологічним аналізом. Однак у цьому дослідженні інші сполуки, що мають сильну антиліпазну активність, могли бути присутніми та не виявлені. Одне обмеження нашого дослідження полягає в тому, що деякі сильнодіючі сполуки в елюації рослин могли бути присутніми в занадто низьких концентраціях, щоб їх можна було виділити та ідентифікувати. Для вирішення цієї проблеми може знадобитися поєднати складну бібліотеку фітотерапії та високопродуктивний скринінг.

Тут було обстежено тридцять п’ять традиційних китайських лікарських трав на антиліпазну активність. Це перший звіт, який показує 20 (S) -гінсенозид Rg3, виділений з Panax notoginseng і хонокіол ізольовані Магнолія лікарська мати антиліпазну активність. Результати цього та попередніх досліджень свідчать про те, що 20 (S) -гінзенозид Rg3 та хонокіол можуть бути сполуками з потужними властивостями проти ожиріння. Тривають подальші дослідження з метою оцінки активності хонокіолу та проти ожиріння 20 (S) -гінзенозид Rg3 на моделях тварин.

Таблиця 1. Інгібуюча активність PPL різних китайських лікарських трав.

Проводили три вимірювання за елюцію. Дані були виражені як середнє ± стандартне відхилення (n = 3). Кінцева концентрація елюцій, використаних при скринінгу, становила 200 мкг/мл.

Таблиця 2. Аналіз маси ESI PN-17-2 і MO-19.

Заява про розкриття інформації

Автори не мають конфлікту інтересів для повідомлення. Автори несуть відповідальність за зміст та композицію статті.

Інформація про фінансування

Автори висловлюють подяку Національній програмі створення та виробництва нових лікарських засобів (2013ZX09402203) за фінансову підтримку.