Гармонізація агрегометрії пропускання світла в Нідерландах шляхом впровадження керівних принципів SSC-ISTH

Стаття дослідження

Повна стаття
Цифри та дані
Список літератури
Цитати
Метрики
Ліцензування
Передруки та дозволи
PDF

Анотація

Вступ

Агрегометрія світлопропускання (ЛТА) вважається золотим стандартним методом дослідження пацієнтів із підозрою на аномалії первинного гемостазу внаслідок успадкованих або набутих дефектів функції тромбоцитів [1]. За цим методом характер агрегації тромбоцитів у відповідь на агоніст вимірюється в багатій на тромбоцити плазмі (PRP) за допомогою турбідометрії [2]. Різні національні та міжнародні рекомендації стверджують, що LTA відіграє важливу роль у діагностичній роботі пацієнтів із тенденцією до кровотеч [3 - 9]. Нові методики, засновані на аналізі цільної крові, напр. імпедансної агрегометрії та аналізатора функції тромбоцитів (PFA), але вони не мають чутливості для виявлення легких порушень функції тромбоцитів [10, 11] або лише доповнюють LTA, такі як проточна цитометрія [12]. Таким чином, LTA продовжує залишатися одним з найбільш корисних інструментів для оцінки підозр на порушення функції тромбоцитів.

Це дослідження мало три цілі:

Дослідити, чи може використання стандартизованого протоколу LTA зменшити варіацію (на концентрацію агоніста) загалом шляхом аналізу максимальної агрегації у здорових добровольців.

Дослідити, чи може використання стандартизованого протоколу ЛТА зменшити варіації у п'яти лікарнях, які брали участь як до, так і після стандартизації, шляхом аналізу максимальної агрегації у здорових добровольців.

Розрахувати національні контрольні значення на концентрацію агоністів, використовуючи результати всіх здорових добровольців після стандартизації.

Матеріали та методи

Лабораторії-учасники

У 2013 році в опитуванні брали участь 10 лабораторій (разом із 129 здоровими суб’єктами) (до стандартизації) та 11 лабораторій (134 здорових суб’єкта) у 2016 році (після стандартизації). П'ять лабораторій брали участь до та після стандартизації. Детальна інформація про учасників зведена в Таблиці I.

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця I. Кількість голландських лабораторій, які брали участь у цьому опитуванні до та після введення стандартизованого протоколу LTA, включаючи прилади, що використовуються для агрегометрії.

Здорові суб’єкти

Здорових добровольців включали анонімно (без реєстрації віку чи статі) з єдиними критеріями виключення прийому препаратів, які, як відомо, перешкоджають функції тромбоцитів. Інформація записувалась натомість голодування, дотримання дієти та легкої їжі перед відбором зразків. Цитратну кров брали у здорових добровольців відповідно до місцевої процедури венепункції, рекомендацій CCKL/ISO-15189 та Гельсінкської декларації WMA.

Інструменти

Більшість лабораторій використовували один тип приладів для LTA, або Chrono-Log Corporation (Haverston, PA, USA), APACT, (LABiTec, Аренсбург, Німеччина), PAP-8 (Biodata Corporation, Horsham, PA, USA) або Aggram (Helena BioSciences, Європа).

Тип інструменту на одного учасника наведено в таблиці I.

До стандартизації в 2013 році кожна лабораторія-учасник використовувала свій місцевий протокол щодо ЗВТ, який тут не буде зазначено. Загалом, до стандартизації в 10 лабораторіях Нідерландів використовували 10 різних процедур для ЛТА.

Різноманітність концентрацій реагентів у 2013 році (до стандартизації) та фіксованих концентрацій, які використовувались після стандартизації у 2016 році, узагальнено у Таблиці II.

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця II. Концентрації агоністів, що використовувались до (2013) та після (2016) стандартизації.

У 2016 році був затверджений національний протокол VHL, заснований на протоколі SSC-ISTH згідно з Cattaneo et al. [18]. Протокол описує аналітичні змінні, що стосуються забору крові та підготовки проб, налаштувань центрифуги, пристроїв та параметрів агрегометрії, які зведені в додаткові таблиці S1 та S2.

Марки використаних реагентів не реєструвались у 2013 році, а реагенти, використані у 2016 році, зведені в Додаткову таблицю S3.

Статистика

Дані анонімували перед імпортом до бази даних та аналізували за допомогою GraphPad Prism 7.0 (програмне забезпечення GraphPad). Відмінності в результатах LTA здорових суб'єктів (які зазвичай не розподіляються) між 2013 і 2016 роками перевіряли на значущість за допомогою непараметричного U-тесту Манна – Уїтні. Референтні інтервали (95% інтервал, нормально розподілений) визначали параметричним аналізом із використанням EP-оцінювача (Data Innovations LLC).

Результати

Загальна різниця в максимальній агрегації здорових добровольців до та після введення стандартизованого протоколу LTA

Рисунок 1a-i демонструє спостереження за зміною максимальної агрегації тромбоцитів з різними концентраціями АДФ, колагену, ристоцетину, адреналіну та арахідонової кислоти у здорових добровольців до та після стандартизації з використанням різних аналізаторів. Концентрації АДФ від 0,5 до 2,5 мкМ (рис. 1а) демонструють загалом високі коефіцієнти варіації (КВ) в максимальній агрегації, що коливається від 5% до 107% при вимірюванні на всіх приладах (рис. 1а). Використання стандартизованого протоколу (2 мкМ ADP) не зменшує CV. Найменші варіації спостерігаються до стандартизації при використанні дещо вищої концентрації АДФ в 2,5 мкМ. Малюнок 1b, c показує, що збільшення концентрації ADP (5 або 10 мкМ) зменшує CV без різниці до або після стандартизації. Проміжні або високі концентрації ADP демонструють незначну мінливість між різними аналізаторами з точки зору максимальних діапазонів агрегації.

Опубліковано в Інтернеті:

Фігура 1. Зміни в результатах LTA здорових добровольців на різних аналізаторах до та після стандартизації. Графіки показують тип приладу (a: Chronolog, b: PAP8, c: APACT, d: AggRAM), лабораторне число та коефіцієнт варіації (CV,%) в максимальній агрегації після стимуляції PRP у здорових суб'єктів з: a) 0,5 –2,5 мкМ ADP низький діапазон, b) 4–5 µM ADP проміжний діапазон, c) 10–20 µM ADP високий діапазон, d) 0,2–2 мкг/мл колаген низький діапазон, e) 4–10 мкг/мл колаген високий діапазон, f) 0,25–0,6 мг/мл низького діапазону ристоцетину, g) 1,0–1,5 мг/мл високого діапазону ристоцетину, h) 5 мкМ адреналіну, i) 0,5–1,6 мМ арахідонової кислоти. Результати виражаються як% максимальної агрегації.

Опубліковано в Інтернеті:

Малюнок 1. продовження

Більш-менш такий же ефект спостерігається і з колагеном. До стандартизації в 2013 р. Низькі концентрації колагену (0,2–2 мкг/мл) демонструють більшу різницю в максимальних результатах агрегації здорових добровольців порівняно з високими концентраціями колагену (4–10 мкг/мл) як на приладах Chronolog, так і на APACT (рис. 1г, д). Після стандартизації в 2016 році низькі концентрації колагену (1–2 мкг/мл) демонструють меншу варіабельність максимальної агрегації на всіх приладах, порівняно з результатами LTA 2013 року (рис. 1г). Фіксована висока концентрація колагену 5 мкг/мл демонструє приблизно ті самі зміни до і після стандартизації (рис. 1д). Як і очікувалось, низькі концентрації ристоцетину призводять до дуже низьких максимальних реакцій агрегації з кількома випадаючими показниками (рис. 1F). Процедура стандартизації не впливає на ці результати. Більш високі концентрації ристоцетину показують показники CV від 3% до 19% до і 3-22% після стандартизації (рис. 1g). Для адреналіну 5 мкМ CV перед стандартизацією є нижчим (рис. 1h). Нарешті, результати LTA арахідонової кислоти відносно стабільні між різними приладами до та після стандартизації (рис. 1i).

Зміни спостережень у результатах LTA для п’яти окремих лікарняних лабораторій, які брали участь як до, так і після стандартизації

Малюнок 2а ілюструє наслідки стандартизації LTA з проміжними дозами ADP для п’яти окремих лікарняних лабораторій, які брали участь в обох опитуваннях. Варіації в максимальній агрегації лікарняних лабораторій 2 і 6 не демонструють явних змін між 2013 і 2016 роками. Стандартизація явно збільшує коливання в максимальній агрегації з проміжними концентраціями АДФ в лікарні 7. На відміну від цього, варіабельність зменшується як в лікарнях 8, так і в 9 після стандартизації у 2016 р. На малюнку 2b наведені результати стандартизації LTA з низькими концентраціями колагену для тих самих п’яти лікарень. Стандартизація, очевидно, зменшує коливання в максимальній агрегації з низькими дозами колагену в 4 з 5 лікарняних лабораторій.

Опубліковано в Інтернеті:

Малюнок 2. Наслідок стандартизації для п’яти окремих лікарень, які брали участь до та після стандартизації. Діаграми демонструють зміни в максимальній агрегації після стимуляції PRP у здорових суб'єктів з а) 4–5 мкМ ADP або б) 1–2 мкг/мл колагену. Результати виражаються як% максимальної агрегації.

Визначення загальних контрольних діапазонів

Референтні інтервали (95% довірчих інтервалів, зазвичай розподіляються) для максимальної агрегації, вираженої у відсотках, для кожного агоніста, були оцінені з використанням даних LTA з усіх здорових контролів (Таблиця III). Для індивідуальних відповідей агоністів загальна кількість досліджених зразків коливалася від 42 до 107.

Опубліковано в Інтернеті:

Таблиця III. Довідкові інтервали LTA (95% довірчий інтервал, зазвичай розподілений) для% максимальної агрегації на концентрацію агоніста після стандартизації.

Максимальна реакція агрегації на низькі концентрації (2 мкМ) АДФ у здорових добровольців показує дуже широкий діапазон результатів (Таблиця III). Однак менша варіабельність спостерігалася при проміжних (5 мкМ) та високих (10 мкМ) концентраціях АДФ. Це також пояснює низькі та високі дози колагену та ристоцетину, адреналіну та арахідонової кислоти (Таблиця III).

Обговорення

На сьогодні LTA все ще є найпоширенішим методом, що застосовується в клінічних лабораторіях для оцінки функції тромбоцитів, і вважається золотим стандартним методом виявлення тромбоцитопатії [23 - 26]. Однак (до) аналітичні аспекти цього методу ще не стандартизовані у всьому світі [15 - 17], незважаючи на різні зусилля експертів, залучених до розробки національних або міжнародних настанов [18 - 22]. Розвиваються новітні техніки, напр. цітометрія цільної крові [12, 27]. Крім того, перспективні результати досягаються дослідженнями агрегації тромбоцитів в умовах потоку [28]. Перевагами цих нових методів є використання цільної крові та низька кількість зразків, але вони також потребують кваліфікованих техніків та спеціалізованого обладнання [29 - 34]. Аналогічним чином, стандартизація традиційного методу LTA тут як і раніше має важливе значення.

На відміну від ADP, низькі дози колагену продемонстрували покращення варіації результатів LTA після стандартизації. Імовірно, це пов’язано з тим, що не кожна лабораторія використовувала один і той же препарат колагену до стандартизації у 2013 р. Різниця між препаратами колагену з бичачого та конячого коней у LTA була описана раніше і може спричинити розбіжності [37]. Аналогічним чином, арахідонова кислота виявила менші варіації в максимальних результатах агрегації після стандартизації. Це неможливо пояснити. У випадку з адреналіном суттєвого ефекту від стандартизації не спостерігалося.

Переваги стандартизації для окремих лабораторій були наявними, але різними. Використання фіксованої концентрації АДФ майже не мало ефекту і не призвело до зменшення коливань у більшості лікарень. Загалом, після стандартизації було менше змін у результатах LTA з фіксованою концентрацією колагену. На закінчення, варіації не були однозначно зменшені після стандартизації, припускаючи, що існує дотримання протоколу.

Можливим поясненням того факту, що загалом спостерігається низьке зменшення варіацій після стандартизації, може бути ефект від запровадження некорегованого PRP, що стало основною зміною для лабораторій після стандартизації. Розведення PRP плазмою, бідною на тромбоцити, для регулювання кількості тромбоцитів вводить артефакти, як пропонують Cattaneo et al. і його слід уникати, оскільки він артефактивно пригнічує агрегацію тромбоцитів [18, 38]. Крім того, це також може призвести до більших коливань через різну кількість тромбоцитів у PRP [39, 40]. Однак робота з некорегованим PRP може також призвести до різниці між здоровими добровольцями. Інше дослідження показує, що LTA з PRP, скоригованим кількістю тромбоцитів, перевершує природний PRP для виявлення розладів кровотечі, хоча користь від них невелика і може не бути клінічно значущою [41]. З іншого боку, Althaus et al. [36] використовував також некорегований PRP та опублікував нижчі показники CV у здорових PRP порівняно з нашими висновками.

Обмеження нашого дослідження полягає в тому, що здорові суб’єкти контролю відрізняються у 2013 році (до стандартизації) та 2016 році (після стандартизації). Крім того, є обмежені дані щодо деяких агоністів, напр. менше 10 донорів на лікарню. Це робить наше дослідження в основному спостережливим. Ми досліджували лише здорових добровольців, а не пацієнтів з тромбоцитопатіями. Переваги стандартизації можуть бути більшими у цій цільовій сукупності; пацієнт із підозрою на розлад кровотечі.

Керівництво CLSI вимагає мінімум 120 нормальних суб'єктів для встановлення контрольних інтервалів. Для такої методики, як LTA, це дорого, трудомістко і неможливо для кожної окремої лабораторії. Запропоновані діапазони в Таблиці III можуть дати вказівки для лабораторій і є директивними. Кожна лабораторія повинна вирішити та обґрунтувати, чи можуть вони використовувати ці значення у щоденному догляді за пацієнтом.

У сукупності наші висновки ілюструють, що стандартизація процедур LTA не обов'язково призводить до менших коливань, особливо для низьких концентрацій агоністів. Для більшості концентрацій агоністів (проміжний та високий АДФ, низький та високий колаген, низький та високий рістоцетин, адреналін та арахідонова кислота) мінливість зменшилась у здорових суб'єктів. VHL все ще закликає всіх користувачів LTA дотримуватися нових рекомендацій.