Папаверин та його похідні радіосенсибілізують солідні пухлини, пригнічуючи метаболізм мітохондрій

Відредаговано Греггом Л. Семензою, Медичною школою університету Джона Гопкінса, Балтимор, доктор медичних наук, та затверджено 10 серпня 2018 р. (Отримано на огляд 24 травня 2018 р.)

Ця стаття має виправлення. Дивіться:

Переглянути пов’язаний вміст:

Значимість

Напруга кисню відіграє вирішальну роль у відповіді на променеву терапію (РТ). Тут ми показуємо, що гіпоксичні пухлини можуть бути сенсибілізовані до РТ шляхом націлення на дихання мітохондрій. Ми визначили 150-річний лікарський засіб, затверджений FDA, папаверин як інгібітор мітохондріального комплексу I. Одноразова доза препарату до початку терапії полегшує гіпоксію в модельних пухлинах і разюче посилює реакцію на RT. Добре оксигеновані нормальні тканини не радіочутливі. Видалення інгібуючої активності фосфодіестерази 10А папаверину шляхом структурної модифікації виявило потенційно безпечнішу генерацію складних I-інгібуючих радіосенсибілізаторів.

Анотація

Гіпоксія пухлини знижує ефективність променевої терапії, обмежуючи біологічно ефективну дозу. Отже, різке збільшення оксигенації пухлини перед променевим лікуванням повинно значно покращити знищення пухлинних клітин після опромінення. Зусилля щодо збільшення доставки кисню до пухлини не показали позитивних клінічних результатів. Тут ми показуємо, що спрямованість на дихання мітохондрій призводить до значного зменшення потреби пухлинних клітин у кисні, що призводить до збільшення оксигенації пухлини та радіаційної реакції. Ми виявили активність схваленого FDA препарату папаверину як інгібітора мітохондріального комплексу I. Ми також надаємо генетичні докази того, що інгібування комплексу I папаверину безпосередньо відповідає за підвищену оксигенацію та посилення радіаційної реакції. Крім того, ми описуємо похідні папаверину, які можуть стати клінічними радіосенсибілізаторами з потенційно меншою кількістю побічних ефектів. Важливо, що ця стратегія радіосенсибілізації не призведе до сенсибілізації добре оксигенованої нормальної тканини, тим самим збільшуючи терапевтичний індекс радіотерапії.

Гіпоксія є загальною мікросередовищем солідних пухлин (1), яка існує, оскільки надходження кисню недостатньо для задоволення метаболічних потреб пухлини (2, 3). Погано сформовані пухлинні судини ускладнюють терапевтичне збільшення доставки кисню для зменшення гіпоксії (4). Більше шести десятиліть тому було визнано, що гіпоксія є перешкодою для ефективної променевої терапії (5). Це становить серйозну клінічну проблему, оскільки понад 50% пухлин отримують променеву терапію в рамках лікування (6).

Молекулярний кисень - це електрофіл, який фіксує індуковану радіацією пошкодження ДНК (7, 8), підвищуючи токсичність у 2,5 рази (9). Таким чином, зменшення пухлинної гіпоксії перед променевою терапією повинно підвищити ефективність випромінювання, не збільшуючи токсичності в добре оксигенованій нормальній тканині. Попередні стратегії полегшення гіпоксії пухлини були спрямовані насамперед на збільшення доставки кисню в пухлину (10, 11). Однак обмежена функціональність судинної системи пухлини виявилася основним обмеженням для перекладу в клініки.

Альтернативною стратегією збільшення оксигенації пухлини є зменшення потреби пухлини в кисні за рахунок пригнічення дихання мітохондрій (12). Обчислювальні моделі передбачали, що зменшення швидкості споживання кисню (OCR) зменшить гіпоксичну фракцію ефективніше, ніж збільшення швидкості доставки (13). Хоча нещодавно для цієї мети було запропоновано кілька препаратів (14), їх трансляційний потенціал обмежений вимогами до поглинання, біологічним періодом напіввиведення сполуки, токсичністю, спричиненою побічними ефектами, або вимогами до мутацій водія, які обмежують застосовність до конкретних підгруп раку. Оптимальний препарат мав би загальне пригнічення OCR, швидке поглинання без необхідності білків-носіїв, короткий період напіввиведення, хороший профіль безпеки та швидкий кліренс від пацієнта.

Результати

Папаверин зменшує OCR, інгібуючи мітохондріальний комплекс I.

Нещодавно було встановлено, що папаверин (PPV) уповільнює ріст клітин у середовищах, що містять лише галактозу як джерело вуглецю (20), що вказує на пригнічення функції мітохондрій. Ми протестували PPV in vitro на панелі з 28 ракових і нормальних клітинних ліній і виявили, що він може знизити функцію мітохондрій у всіх клітинах, що випробовуються за лічені хвилини при низьких мікромолярних концентраціях (рис. 1А та Додаток SI, таблиця S1). Щоб визначити його механізм дії, ми протестували PPV у поєднанні з встановленими мітохондріальними отрутами та виявили, що він може залежно від дози блокувати активність класичного інгібітора комплексу I ротенону (рис. 1B), що свідчить про певну конкуренцію двох препаратів. В аналогічному аналізі з іншими інгібіторами комплексу I пієрицидином А або капсаїцином взаємодії не було (додаток SI, рис. S1 A і B). Це свідчить про те, що PPV може зв'язуватися з ротеноновим сайтом або, можливо, його зв'язування блокує цей сайт, узгоджуючись з опублікованими даними (21). Щоб підтвердити, що PPV інгібує комплекс I, ми обробляли пермеабілізовані клітини EO771 або PPV, або ротеноном, а потім сукцинатом субстрату комплексу II, який може обійти інгібування комплексу I. 1С показано, що сукцинат врятував OCR як клітин, оброблених ротеноном, так і клітинами, обробленими PPV, але не клітин, оброблених інгібітором комплексу 3 антиміцином A, підтверджуючи, що дія PPV відбувається вище за комплекс 2 (рис. 1C).

Папаверин знижує OCR шляхом інгібування мітохондріального комплексу I. (A) Репрезентативні дані морського коника, що свідчать про зниження OCR у клітинах EO771. (B) Аналіз конкуренції між папаверином та ротеноном, що вводяться, як зазначено в клітинах EO771. (C) Сукцинатний рятувальний тест у пермеабілізованих клітинах EO771. PPV або ротенон вводили окремо або в комбінації з інгібітором комплексу III антиміцином А (AntA) в момент А; сукцинат (Succ) вводили в момент часу B. (D) Аналіз реакції доза-відповідь у клітинній лінії A549. (E) Експеримент з вимивання ліків у клітинах A549, зменшення OCR через 3 год 10 мкМ PPV або 1 мкМ ротенону (пурпуровий) та після видалення через T-2 год (синій) або 1 год (чорний). Смужки помилок представляють SD.

Щоб оцінити ефективність PPV як інгібітора комплексу I, ми обробляли клітини A549 із збільшенням доз PPV та ротенону. Аналіз реакції дози показує, що IC50 PPV для OCR на ∼100 × вище, ніж у ротенону (рис. 1D). Ми також порівняли ефект PPV з іншими препаратами, запропонованими для використання в якості метаболічних радіосенсибілізаторів, метформіну та атавакуону (Додаток SI, рис. S1C). Аналіз морського коника in vitro показав, що хоча PPV та атовакуон займали 30 хв (рис. 1А), метформіну потрібно 24 години (у концентраціях мМ), щоб досягти повного гальмування мітохондрій. Ідеальні метаболічні радіосенсибілізатори повинні мати оборотну активність, щоб потенціал токсичності був обмеженим. Цікаво, що мітохондріальний ефект PPV є оборотним in vitro у порівнянні з потенційно більш токсичними незворотними ефектами ротенону (22) та атавакуону. У експериментах з вимивання лікарських засобів клітини, оброблені PPV, поверталися до вихідного рівня OCR менш ніж за 1 год, тоді як клітини, оброблені ротеноном та атоваквоном, не виявляли відновлення функції мітохондрій через 3 год. Ця властивість може пояснити чудовий профіль безпеки папаверину (15) (рис. 1E та Додаток SI, рис. S1D). На підтвердження своєї безпеки ми не спостерігали клітинної токсичності в клітинах, оброблених PPV, ні в нормоксії, ні в гіпоксії (Додаток SI, рис. S1 E і F).

Папаверин зменшує гіпоксію пухлини та посилює реакцію на променеву терапію.

Папаверин радіосенсибілізується через інгібування комплексу I. (А) Вестерн-блот експресії NDI1 у мітохондріальних фракціях батьківських клітин A549 та NDUFV1 KO. (B) Репрезентативна життєздатність трипанового синього (n = 3) клітин, вирощених у середовищах, що містять лише галактозу (T = 96 год). Значення представляють середні життєздатні клітини ± SD. (C) Аналіз морського коника на відповідь батьківських клітин A549 та NDUFV1 KO ± NDI1 на 10 мкМ папаверину або 1 мкМ ротенону. Значення є середніми ± SD. (D) Кількісне визначення фарбування пімонідазолом у пухлинах флангу NDUFV1 KO NDI1, оброблених 2 мг/кг PPV або носія (n = 3). Значення є середнім пімонідазол-позитивними клітинами з 20 зображень на пухлину ± SEM. Значення P розраховували за допомогою t-тесту. (E) Кількісне визначення затримки росту пухлини гетеротопних ксенотрансплантатів NDUFV1 KO NDI1, які отримують або 8 Gy XRT (пурпуровий), або 2 мг/кг PPV за 35 хв до 8 Gy XRT (синій) (n = 4). Криві представляють середні обсяги пухлини ± SEM. Значення P розраховували щодо XRT за допомогою t-тесту. н.с., не має значення.

Папаверин може бути реконструйований для видалення активності, що інгібує PDE.

Вимірювання часткового кисневого тиску in vivo.

Фарбування пімонідазолом.

Аддукти пімонідазолу візуалізували в гіпоксичних областях в межах гістологічних зрізів тканин пухлини (39). Мишей, які несли ксенотрансплантати EO771 та A549, обробляли 2 мг/кг PPV або фізіологічним розчином, а через 30 хв - 60 мг/кг внутрішньовенного введення пімонідазолу, а пухлини збирали через 90 хв. Заморожені зрізи фарбували антитілами до пімонідазолу на кроликах та анти-кроликом Alexa Fluor 488. Гіпоксичну фракцію кожної пухлини визначали кількісно шляхом порогового сигналу на рівні 50% від максимального сигналу на контрольних зрізах. Площу, покриту пімонідазол-позитивними клітинами, оцінювали з 20 зображень на тварину та усереднювали.

Кінетика росту пухлини.

Клітини 2 × 10 6 EO771 або 5 × 10 6 A549 вводили s.c.c. на фланги 6-тижневих жіночих імунокомпетентних мишей C57/B6 (EO771) або імунокомпрометованих мишей nu/nu (A549). Вимірювання суппорта протилежного діаметра використовували для розрахунку обсягів пухлини. Досягнувши 150 мм 3, пухлини візуалізували за допомогою КТ конусного пучка, і плани лікування розраховували за допомогою програмного забезпечення SARRP. Рентгенівські промені доставляли одним пучком, доставляючи 5 Гр, використовуючи радіаційну платформу для досліджень малих тварин (SARRP; Xstrahl). Обсяги пухлини вимірювали до тих пір, поки обсяг після лікування не збільшився втричі.

Аналіз кишкової склепи.

Миші дикого типу C57/B6 отримували абдомінальну дозу XRT у 7,5 Гр, доставлену за допомогою SARRP. Розрізану тонку кишку фіксували 10% натуральним буферизованим формаліном (NBF) перед тим, як вкласти у парафін. Антитіло проти Ki67 (Thermo Scientific RM-9106-S) було виявлено козячим анти-кроликом Vector Laboratories (хромоген DAB).

Подяки

Ми вдячні Кайлу Портеру за його статистичні дані та Navdeep Chandel за експресійну плазміду NDI1. Фінансування здійснювали гранти NIH P01CA016776 та R01CA163581.

Виноски

↵ 1 Поточна адреса: Інститут розробки нових лікарських засобів, Китайський медичний університет, Тайчжун 404, Тайвань.

Вклади авторів: E.G., Q.-T.L., A.C.K., A.J.G., S.-C.C. та N.C.D. розроблені дослідження; M.B., X.H., S.V., S.S., J.W. та I.P. виконані дослідження; X.H. та B.Y. внесли нові реагенти/аналітичні інструменти; M.B., S.V., J.W., E.G., Q.-T.L., A.C.K., A.J.G., S.-C.C., I.P. та N.C.D. проаналізовані дані; та М.Б. та N.C.D. написав роботу.

Автори не заявляють конфлікту інтересів.