Оцінка безпеки та захисних ефектів екстракту кореня Potentilla fulgens при експериментально індукованій діареї у мишей

Варейшанг Тангпу

Кафедра зоології, Університет Північно-Східного Хілла, Шиллонг, Мегалая, Індія

Хірод Деорі

Кафедра зоології, Університет Північно-Східного Хілла, Шиллонг, Мегалая, Індія

Арун Кумар Ядав

Кафедра зоології, Університет Північно-Східного Хілла, Шиллонг, Мегалая, Індія

Анотація

Коріння Potentilla fulgens Wall. колишній Гачок. (Rosaceae) використовувались у системі корінної медицини на північному сході Індії для лікування діареї. Метою цього дослідження було дослідити безпеку та захисні ефекти екстракту кореня P. fulgens при експериментально індукованій діареї у мишей.

Матеріали та методи:

Захисні ефекти екстракту кореня P. fulgens досліджували проти експериментально індукованої діареї у мишей за допомогою чотирьох експериментальних моделей, тобто вимірювання випорожнень калу, моделі рицинової олії, аналізу внутрішньосполучення простагландину Е2 (PGE2) та шлунково-кишкового транзитного тесту. Оцінку безпеки екстракту коренеплодів проводили у мишей на основі загальних ознак та симптомів токсичності, споживання їжі та смертності тварин після обробки різними дозами екстракту (100-3200 мг/кг). Крім того, для оцінки токсичності екстракту кореня також проводили моніторинг глутамат-оксалоацетат-трансамінази сироватки, глутамат-піруват-трансамінази сироватки, холестерину та загального білка.

Результати:

У дослідженнях з оцінки безпеки екстракт кореня P. fulgens не виявляв жодних видимих ознак токсичності, але смертність спостерігалась у однієї тварини при дозі 3200 мг/кг екстракту. Екстракт також не виявив жодного несприятливого впливу на досліджувані параметри сироватки експериментальних тварин. У протидіарейних тестах введення мишам дози екстракту 800 мг/кг показало 50% захист від діареї, викликаної касторовою олією. Крім того, екстракт також показав зниження кишкової секреції, викликаної PGE2, на 29,27% порівняно з 30,31%, зареєстрованим для лопераміду, стандартного протидіарейного препарату.

Висновки:

Результати цього дослідження вказують на те, що екстракт кореня P. fulgens має значні протидіарейні властивості. Тому коріння цієї рослини можуть бути ефективним традиційним ліками для захисту від діареї.

ВСТУП

Діарея є однією з основних причин захворюваності та смертності серед дітей у країнах, що розвиваються [1]. Із понад 2,3 мільйона щорічних випадків смерті серед дітей серед дітей лише 334 000 є причиною діарейних захворювань [2]. Для боротьби з проблемами діареї у світовому масштабі Всесвітня організація охорони здоров’я у своїй програмі боротьби з діареєю зробила особливий акцент на застосуванні традиційних фольклорних препаратів для контролю та лікування діареї [3]. Лікарські трави є незамінним компонентом традиційної медицини, що практикується у всьому світі завдяки їх легкій доступності. Застосування рослинних препаратів для лікування діарейних захворювань є звичною практикою у багатьох країнах, що розвиваються [4]. В Індії використання рослинних препаратів для лікування діарейних захворювань особливо частіше зустрічається в північно-східному регіоні, де проживає кілька корінних племен [5-7].

Potentilla fulgens Стіна. колишній Гачок. (Rosaceae) [Рисунок 1] - це жовта трава висотою 1-2 фути. В Індії він росте на висотах 1500-2000 мсм у штатах Сіккім, Ассам, Мегалая, Маніпур та Нагаланд. Попередні експериментальні дослідження на цій рослині показали, що екстракт його кореня має протипухлинну [8], антиоксидантну [9], гастропротекторну [10] та антигельмінтну [11] активність. У той час як фітохімічні дослідження на P. fulgens виявили, що він містить кілька терпенів, а саме потентен А, потентен В, а також гіптадієнову, мучну та розамультову кислоти, крім фенольних сполук. епікатехін та епіафзельхін, флавоноїдний потіфулген та глікозид. рутин [12,13].

Potentilla fulgens: ціла рослина і квітка

Під час наших етнофармакологічних досліджень в Маніпурі, Індія, ми помітили, що свіжі корені P. fulgens (народна назва: Ngarunri) або жуються, або приймаються у вигляді відвару для лікування діарейних розладів місцевим жителем . Опитування літератури не виявило повідомлень про протидіарейні ефекти цього виду рослин. Тому, розглядаючи етномедицинське використання цієї рослини проти діареї в Маніпурі, Індія, у цьому дослідженні ми були зацікавлені дослідити безпеку та захисні ефекти екстракту кореня P. fulgens при експериментально викликаній діареї у мишей.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Приготування рослинних екстрактів

Рослинний матеріал для цього дослідження був зібраний в Маніпурі, Індія, і засвідчений доктором Гурунгом, куратором гербарію, департаментом ботаніки, Університет Північно-Східного Хілла (NEHU), Шиллонг. Також було підготовлено гербарійний запис матеріалу, якому було присвоєно номер ваучера, тобто AKY 221, який був зданий на зберігання в Департамент зоології, NEHU, Шиллонг. Коріння сушили під тінню і подрібнювали в порошок. Відомі кількості порошкоподібних матеріалів суспендували в метанолі і використовували для кип'ятіння із зворотним холодильником із застосуванням апарату фракційної дистиляції Сокслета при 40-50 ° С протягом 4-6 год. Отриману суспензію зливали, викидаючи залишки, і фільтрат далі концентрували у ротаційному випарнику при зниженій температурі та тиску для видалення розчинника. Відсоток виходу кінцевого екстракту становив 5,15% мас./Мас.

Використовувані наркотики та хімікати

Лоперамід (Lopax, Axar Pharmaceuticals, Baroda, India) використовували як стандартний протидіарейний препарат. Касторова олія (Fine, Мумбаї, Індія) та простагландин E2 (PGE2) (Sigma-Aldrich Chemical Pvt. Ltd., США) як засоби, що індукують діарею, активоване вугілля (Merck, Індія) як маркер кишкового транзиту та акація камеді ( У цьому дослідженні в якості суспензійних агентів використовували порошок Fine Chem, Boisar, India) та порошок Tragacanth (Central Drug House Pvt. Ltd., Бомбей, Індія).

Експериментальні тварини

Самці та самки швейцарських мишей-альбіносів віком 6-8 тижнів (20-30 г) були закуплені в Інституті Пастера, Шиллонг, Мегалая, і поодинці розміщені в клітці з полікарбонату з вільним доступом до стандартної дієти для гризунів та водопровідної води за бажанням. Тварин акліматизували до лабораторного стану протягом 7 днів перед експериментами та підтримували при 25 ± 3 ° C при циклі світла/темряви 12 годин. Всі процедури в цьому дослідженні проводились згідно з керівництвом Комітету з інституційної етики (тваринна модель) NEHU, Шиллонг та Комітету з метою контролю та нагляду за експериментами на тваринах. Інструкція Індійської ради з медичних досліджень, Нью-Делі.

Тест на гостру оральну токсичність

Визначення середньої летальної дози (LD50)

Мишей відбирали випадковим чином і розділяли на сім груп по шість тварин у кожній. Група I служила контролем, а II-VII отримували одну пероральну дозу досліджуваного екстракту з коефіцієнтом прогресування дози два при 100, 200, 400, 800, 1600 та 3200 мг/кг відповідно. Тварини голодували протягом 3 год від їжі, але не води, перед введенням доз. Загальні ознаки та симптоми токсичності, споживання води з їжею та смертність тварин спостерігали протягом 72 годин після обробки. З цих спостережень LD50 розраховували за допомогою програмного забезпечення SPSS.

Біохімічні тести сироватки

В іншому експерименті мишей розділили на дві групи по шість тварин у кожній для вивчення впливу тестового екстракту на різні біохімічні профілі сироватки крові. І група служила контролем, а ІІ групі давали 800 мг/кг одноразової пероральної дози екстракту (найвища доза, перевірена на протидіарейну активність у цьому дослідженні). Тварини голодували протягом 3 год від їжі, але не води, перед введенням доз. Наприкінці експерименту, тобто через 24 години після обробки, тварин забивали шляхом вивиху шийки матки. Зразки крові відбирали шляхом серцевої пункції і витримували протягом 30 хв без порушення, а потім центрифугували протягом 15-20 хв при 2000 об/хв для відділення сироватки. З цієї обробленої сироватки рівні глутамат-оксалоацетат-трансамінази сироватки (Комісія ферментів [ЄС], 2.6.1.1), глутамат-піруват-трансамінази сироватки (ЄС 2.6.1.2), холестерин та загальний білок оцінювали стандартними методами [14-16], використовуючи напівавтоматизований біохімічний аналізатор (Bayer).

Антидіарейна активність

Протидіарейну ефективність екстракту оцінювали за допомогою наступних чотирьох експериментальних моделей діареї у мишей.

Вимірювання фекальних показників (FOP)

Вихід фекалій вимірювали за методами Баса [17] та Піллая [18] із модифікаціями. Тварин розділили на шість груп (n = 6), група I служила контролем і отримувала 2% камеді акації (0,5 мл); Групи II-V отримували відповідно 100, 200, 400 та 800 мг/кг рослинного екстракту, тоді як VI група отримувала 0,5 мл стандартного протидіарейного препарату лопераміду у дозі 5 мг/кг. Через 8 годин після обробки фекальні матеріали збирали, сушили в інкубаторі та реєстрували їх вагу. Відсоток FOP розраховували і виражали у вигляді процентного зменшення наступним чином:

Де ft - середня калова маса кожної групи лікування, а fc - контрольної групи [19].

Модель касторової олії

Метод був модифікований від Jacoby et al. [20], Otshudi та ін. [21] і був описаний раніше Тангпу та Ядавом [6]. Мишей, що голодували протягом ночі, випадковим чином розділили на шість груп (n = 6). I група отримувала 0,5 мл 2% суспензії акації з камеді; Групи II-V обробляли відповідно 100, 200, 400 та 800 мг/кг рослинного екстракту; Мишам групи VI давали 0,5 мл 5 мг/кг лопераміду. Через годину діарею викликали у всіх групах шляхом посіву касторової олії (0,5 мл/миша, перорально). Кількість епізодів діареї реєстрували кожен раз, і кумулятивні значення розраховували протягом 4 год після індукції діареї, а кількість тварин, позбавлених діарейного посліду через 4 год, розглядали як відсоток захисту від діареї.

Аналіз PGE2-Enteropooling

Протокол прийнятий від Роберта та ін. [22] із змінами, описаними раніше Тангпу та Ядавом [6]. Мишей, що голодували протягом ночі, рандомізували в сім груп (n = 6). Тварини отримували PGE2 як діарейний засіб (0,5 мл 100 мкг/кг PGE2 у 5% етанолі у фізіологічному розчині). I група служила контролем (0,5 мл; 2% камеді акації); II група служила контролем носія (100 мкг/кг PGE2 + 2% акації камеді); III-VI групи отримували відповідно 100, 200, 400 та 800 мг/кг рослинного екстракту; VII група отримувала дозу лопераміду 5 мг/кг. Всі ці обробки проводили за 1 год до індукції PGE2-діареї. Через 30 хв тварин приносили в жертву, а їх тонку кишку перев'язували від пілоричного сфінктера до ілеоцекального з’єднання і проводили оцінки накопичення секреції кишкової рідини, індукованої PGE2, і обчислювали у відсотковому відношенні.

Шлунково-кишковий транзитний тест

У цьому тесті мишей розділили на шість груп (n = 6) і їм дозволили голодувати протягом 16 годин до експерименту. Група I служила контролем, групи II-V обробляли тестовим екстрактом у дозі 100, 200, 400 та 800 мг/кг перорально відповідно. Тварини VI групи отримували 5 мг/кг лопераміду. Через 5 хв кожній миші перорально інокулювали 0,5 мл вугільного шроту. Через 30 хв усіх мишей жертвували, тонкий кишечник від пілоруса до сліпої кишки вирізали, відстань, пройдену вугільним маркером, вимірювали і виражали у відсотках від загальної довжини тонкої кишки. Відсоток інгібування транзиту маркера в кишечнику розраховували, як описано Акахом і Оффією [23].

Аналіз

Вплив екстракту кореня Potentilla fulgens на рівні SGOT, SGPT, холестерину та білка після 24-годинної обробки мишей дозою екстракту 800 мг/кг. SGOT: глутамат-сироватковий оксалоацетат-трансаміназа, SGPT: сироватковий глутамат-піруват-трансаміназа, найхоліший: холестерин. Значення наведені як середнє значення ± стандартне відхилення, t-критерій Стьюдента (n = 6). Під час лікування не спостерігалось значних змін біохімічних показників сироватки крові у контрольних мишей

Антидіарейна активність

Вимірювання ФОП

Екстракт рослини помірно знижував FOP порівняно зі стандартним препаратом лоперамідом залежно від дози. Встановлено, що при дозі 800 мг/кг процентне зниження ФОП становить 26,37%, тоді як лоперамід при концентрації 5 мг/кг демонструє зниження ФОП на 41,76% [Рисунок 3].

Вплив на аналіз PGE2-Enteropooling

Виявлено, що відмінності у зменшенні інгікованої PGE2 кишкової секреції рослинним екстрактом виявляються слабко значущими в залежності від дози порівняно з контролем. Екстракт зменшив кишкову секрецію на 29,27% при дозі 800 мг/кг. Відсоток зменшення дози лопераміду на 5 мг/кг показав 30,31%, що було майже порівнянно з дозою екстракту 800 мг/кг [Малюнок 3].

Вплив на шлунково-кишковий транзитний тест

Встановлено, що інгібування транзиту вугільного шроту по тонкому кишечнику в обробленій групі становило 23,18% при дозі екстракту 800 мг/кг [рис. 3]. Хоча рослинний екстракт демонстрував статистично значуще пригнічення транзиту вугільного шроту порівняно з контролем, було помічено, що інгібування найвищою випробуваною дозою 800 мг/кг було порівняно низьким порівняно з 44,37%, зареєстрованим для дози лопераміду 5 мг/кг.

ОБГОВОРЕННЯ

У дослідженні гострої токсичності рослинний екстракт не виявляв жодних видимих ознак токсичності, проте смертність спостерігалась у однієї тварини при дозі 3200 мг/кг екстракту. Ми припускаємо, що причина смертності лише у окремих мишей могла бути зумовлена іншими фізіологічними факторами, а не несприятливим впливом екстракту, оскільки у решти тварин видимих ознак токсичності не спостерігалося. Нещодавнє дослідження також перевірило гостру токсичність екстракту кореня P. fulgens і не виявило смертності чи симптомів токсичності у тварин до 4000 мг/кг [10]. У цьому дослідженні також не зафіксовано жодних суттєвих відмінностей у будь-якому з досліджуваних біохімічних показників сироватки між обробленим екстрактом (доза 800 мг/кг) та контрольною групою тварин. На основі цих висновків можна сказати, що екстракт кореня P. fulgens не має токсичних ефектів у експериментальних тварин до дози 3200 мг/кг.

У цьому дослідженні рослинний екстракт демонстрував значну протидіарейну активність у всіх чотирьох випробуваних моделях діареї. Діарея виникає внаслідок дисбалансу між абсорбційним та секреторним механізмами в кишковому тракті, що супроводжується гіпермоторикою та поспіхом кишечника, що призводить до надмірної втрати рідини через обличчя [25]. Отже, більшість досліджень проти діареї на тваринах в основному зосереджені на абсорбційному, антисекреторному чи антимоторичному впливі досліджуваних речовин [5,6].

Це дослідження показало, що рослинний екстракт знижує FOP тварин залежно від дози, що вказує на наявність антисекреторної або просорбційної властивості в екстракті. Лалу та ін. [10] також повідомляли, що 200 і 400 мг/кг, р.о. доза етанолового екстракту коріння P. fulgens суттєво пригнічує етанол та пілоричну перев’язку, викликану виразкою шлунка, завдяки своїм антисекреторним властивостям.

У наших попередніх дослідженнях ми повідомляли про деякі інші протидіарейні рослини, а саме. C. citratus та R. javanica з того ж регіону [5,6]. Ці дві рослини демонстрували порівняно кращу протидіарейну активність, ніж те, що спостерігалося для P. fulgens у цьому дослідженні. Кілька протидіарейних досліджень показали, що рослинні екстракти, що містять дубильні речовини, флавоноїди, алкалоїди, сапоніни та стероїди, як правило, мають значну протидіарейну активність [29, 30], і найчастіше рослини, що містять танін, використовують для лікування діареї та дизентерії в традиційних лікарських засобах [31]. Наприклад, Nsaka Lumpu et al. [32] оцінив фітохімічну та протидіарейну властивість Alstonia congensis та припустив, що протидіарейний ефект цієї рослини значною мірою сприяв наявності дубильних речовин. Також відомо, що дубильні речовини є важливими складовими видів Potentilla, і тому, найімовірніше, протидіарейний ефект цієї рослини обумовлений компонентами дубильних речовин [33].

ВИСНОВОК

Це дослідження чітко свідчить про те, що екстракт кореня P. fulgens має значну протидіарейну активність і безпечний для використання як традиційна медицина. Однак необхідні подальші дослідження, щоб виділити та ідентифікувати активні інгредієнти цієї рослини, щоб зрозуміти точний механізм протидіарейної дії.

ПОДЯКИ

Варейшанг Тангпу отримав молодшу наукову стипендію Ради наукових та промислових досліджень у Нью-Делі. Ми вдячні NEHU, Shillong за надання необхідних дослідницьких можливостей для проведення цієї роботи.