Не впливає 600 грамів фруктів та овочів на день на окислювальні пошкодження та відновлення ДНК у здорових некурящих

Анотація

Вступ

Результати епідеміологічних досліджень вказують на те, що велике споживання фруктів та овочів пов'язане зі здоровим способом життя та низьким рівнем захворюваності на рак (1). Ймовірно, декілька механізмів беруть участь у сприятливому впливі фруктів та овочів, включаючи вітаміни, клітковину та кілька інших біоактивних сполук з менш добре охарактеризованими ефектами. Крім того, овочі та фрукти мають високий вміст антиоксидантів, які здатні поглинати ROS4 (2) і, ймовірно, також пригнічують їх утворення (2, 3) .

Теоретично ураження ДНК перетворюються на мутації in vivo, якщо вони не видаляються з геному системою відновлення ДНК. У клітинах ссавців пошкодження ДНК можуть бути вирізані двома різними типами систем висічення ДНК, а саме відновленням базового висічення та відновленням нуклеотидів. ERCC1 відіграє важливу роль у процесі відновлення нуклеотидів як частину 5'-розрізного комплексу (9). Основний фермент висічення, OGG1, видаляє з ДНК переважно окислений гуанін (10). Наскільки нам відомо, експресія генів ERCC1 та OGG1 раніше не досліджувалась щодо споживання фруктів та овочів.

Метою цього дослідження було порівняти рівень окислювального пошкодження ДНК та відновної активності у лейкоцитах між виснаженими фруктами, овочами та антиоксидантами та суб'єктами, що отримували 600 г фруктів та овочів на добу або добавки з відповідним вмістом вітамінів і мінерали.

Матеріали та методи

Дизайн та предмети дослідження.

Дослідження було розроблено паралельно, а випробовувані були рандомізовані за трьома групами: щодня споживали 600 г фруктів та овочів; вітамінні таблетки з однаковою кількістю антиоксидантів та мінералів; або відсутність антиоксидантів (таблетка плацебо) протягом 24 днів. Дослідження було схвалено Науково-етичним комітетом муніципалітетів Копенгагена та Фредеріксберга (01-234/99).

Приоритетна гіпотеза полягала в тому, що у групі плацебо спостерігатиметься підвищений окислювальний ушкодження ДНК через виведення дієтичних антиоксидантів, тоді як окисне пошкодження ДНК у вітамінній групі та у фруктово-овочевій групі залишатиметься незмінним або зменшуватиметься через збільшення споживання протягом навчання. Експресія генів відновлення ДНК досліджувалася без будь-яких апріорних гіпотез, оскільки це раніше не перевірялося в дослідженнях дієтичного втручання. Перед дослідженням ми підрахували, що розмір групи повинен складати 15 суб'єктів, щоб спостерігати збільшення ефекту на 50% у групі плацебо при α = 5% і β = 20% і припускаючи 50% коефіцієнт варіації, як це спостерігалося раніше для аналізу на комети і екскреція 8-оксидG із сечею (11, 12, 13, 14). Ми вважали, що розумно розраховувати на різницю в 50%, оскільки кілька досліджень, що демонструють захисний ефект антиоксидантів, повідомляли про більші ефекти на рівень окислювального пошкодження ДНК або чутливості до H2O2 після втручання з натуральними продуктами харчування або полівітамінними таблетками (15, 16, 17, 18, 19, 20) .

Здорових чоловіків та жінок нормальної ваги набирали для дослідження за рекламою в університетах та інших закладах, а також у місцевій газеті. Критеріями виключення були куріння, ожиріння, хронічні захворювання в сімейному анамнезі, гіпертонія, вживання ліків та важкі фізичні вправи. Сорок вісім суб'єктів було набрано для дослідження після того, як вони дали інформовану згоду. Загалом дослідження виконали 43 суб’єкти (22 чоловіки та 21 жінка у віці 21–56 років). Один суб’єкт кинув навчання, оскільки він не міг бути присутнім на обіді протягом певного інтервалу часу, а 4 суб’єкти кинули через події, не пов’язані з дослідженням. Базові характеристики суб’єктів, які закінчили дослідження, наведені в таблиці 1 ⇓ .

Характеристики суб’єкта та концентрація вітаміну С та каротиноїдів у плазмі крові у трьох групах на вихідному рівні (середнє значення та SD) a

Перед початком контрольованої дієти випробовувані протягом 4 днів вели повну зважену дієту та заповнювали перевірену анкету щодо частоти їжі (21). Згідно з цими даними, звичне споживання фруктів та овочів становило 80280 г/день. Випробовуваних розподіляли на фіксовані індивідуальні споживання енергії залежно від маси тіла, віку та рівня фізичної активності (ВООЗ). Протягом дослідження, вага тіла вимірювалася щодругого дня, і якщо вага варіювалась> 1 кг, випробовуваних розподіляли на інший енергетичний рівень або повідомляли про споживання додаткової енергії (забезпечується енергетичними роликами з однаковим складом макроелементів, як і загальна дієта) . Середнє споживання енергії під час дослідження становило 13 МДж (діапазон, 9–17 МДж).

Склад експериментальної дієти (грами свіжої ваги/добу) при споживанні енергії 10 МДж/добу

Зразки крові натще для аналізу окисного пошкодження ДНК та експресії мРНК брали до (день -1), на 9, 16 та 24 день під час втручання та через 4 тижні (день 52) після закінчення втручання, коли учасники мали відновили звичні дієти. Двадцять чотири години зразків сечі відбирали до, чотири рази протягом періоду втручання та під час спостереження через 4 тижні після закінчення втручання.

Виявлення пошкодження окислювальної ДНК в мононуклеарних клітинах крові та сечі.

24-годинна екскреція 8-оксиду G із сечею визначалася високоефективною рідинною хроматографією та електрохімічним виявленням, як було описано раніше, і виражалася як нмоль/24 год (5) .

Кількість OGG1 і ERCC1 Експресія мРНК у лейкоцитах.

Загальну РНК очищали від 1,5 мл EDTA стабілізованої повноцінної крові за допомогою набору ізоляції РНК крові Qiagen, а експресію мРНК OGG1 та ERCC1, нормалізовану до 18S РНК, визначали методом зворотної транскрипції-ПЛР у режимі реального часу, як описано в іншому місці (22). Зондами та праймерами для OGG1 були: прямий праймер, 714F, 5′-AAATTCCAAGGTGTGCGACTG-3 ′; зворотна грунтовка, 796R, 5′-GCGATGTTGTTGTTGGAGGA-3 ′; і зонд, 5′-FAM-CAAGACCCCATCGAATGCCTTTTCTCTTT-TAMRA-3 ′. Зондами та праймерами для ERCC1 були: прямий праймер, 512F, 5′-GGCGACGTAATTCCCGACt-3 ′; зворотна грунтовка, 576R, 5′-TAGCGGAGGCTGAGGAACA-3 ′; та зонд: 5′-FAM-TGTGCTGGGCCAGAGCACCTGT-TAMRA-3 ′. Праймери та зонди були отримані від Applied Biosystems.

Рівні плазми вітаміну С і переклад-β-каротин.

Рівні вітаміну С та каротиноїдів у плазмі крові, включаючи транс-β-каротин, аналізували, як повідомлялося раніше (23, 24). Повне висвітлення змін у концентрації плазмових антиоксидантів у трьох групах буде опубліковано в інших роботах.

Статистика.

Результати

На початку споживання енергії з вуглеводів, жирів та білків не відрізнялося між групами. Не було різниці між споживанням алкоголю та споживанням фруктів та овочів між групами (Таблиця 1) ⇓. Визначено за вихідними зразками крові, вміст у плазмі вітаміну С та β-каротину не відрізнявся між групами (табл. 1) ⇓. Крім того, не було різниці в рівні біомаркерів окисного пошкодження ДНК та відновлення між групами на вихідному рівні. Отже, це свідчить про те, що рандомізація була успішною.

Протягом періоду втручання концентрація вітаміну С та β-каротину у плазмі крові знижувалась відповідно на 69 та 47% у групі плацебо, тоді як високі концентрації вітаміну С в плазмі підтримувались у групі фруктів та овочів та групах, що отримували добавки (Таблиця 3 ) ⇓. Після 3 тижнів прийому всередину вміст β-каротину в плазмі крові збільшився у фруктово-овочевій групі та у вітамінній таблетці.

Концентрація вітаміну С та β-каротину у плазмі на початковому рівні та на 24 день після 3 тижнів втручання (середнє значення та СД)

Стабільний рівень пошкодження окислювальної ДНК в мононуклеарних клітинах крові (аналіз комети).

Кожне вимірювання зразка включало розриви стійок та чутливість до H2O2, а також окисне пошкодження ДНК, виявлене ENDOIII та FPG (таблиця 4) ⇓. Жодна з кінцевих точок дієтичного втручання не впливала. Були здійснені спроби різних типів стандартизації (тобто віднімання між зразками та контролем), проте це не свідчило про те, що повсякденні зміни маскували біологічні ефекти аналізу. Статистичний аналіз показав вплив пошкодження, спричиненого H2O2, на 16 день у всіх групах (P Переглянути цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно

Рівень розривів ланцюга ДНК, чутливі до ENDOIII- та FPG ділянки та чутливість до перекису водню в мононуклеарних клітинах крові, виявлених методом комети (середнє значення та SD) a, b

Для кожного циклу електрофорезу ми включали кріоконсервовані мононуклеарні клітини крові для виявлення розривів ланцюгів та обробки H2O2 (150 мкм). Середнє значення SD становило 29 ± 11 для розривів ланцюгів та 93 ± 21 для клітин, оброблених H2O2 (n = 32). FPG-чутливі ділянки в мононуклеарних клітинах становили 62 ± 24, а середнє значення і SD свіжооброблених H2O2 (150 мкм) одноядерних клітин були 52 ± 16 (n = 32). Варіація розривів ланцюгів була подібною до попередньо описаної варіації аналізу (14) та варіації аналізу, про яку повідомлялося в інших дослідженнях біомоніторингу (25, 26, 27) .

Виведення з сечею 8-OxodG.

Не було різниці в екскреції 8-оксидГ між трьома споживаними дієтами (табл. 5) ⇓. Однак був ефект періоду, коли зразки, відібрані після періоду втручання, були нижчими, ніж в інші періоди відбору проб (P Переглянути цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно

Рівень екскреції 8-оксидГ із сечею (середнє значення та SD) через 24 години a

Вирази OGG1 і ERCC1 мРНК в лейкоцитах.

Вирази OGG1 та ERCC1 наведені в таблиці 6 ⇓. Експресію мРНК OGG1 та ERCC1 визначали протягом 9 різних днів під час дослідження. Опис повного набору виразів мРНК подано в іншому місці (22). Наведені тут дані лише описують вирази протягом 5 днів з аналізом комет та вимірюванням екскреції 8-oxodG з сечею. Рівні експресії мРНК двох генів відновлення ДНК не були пов'язані зі споживаною дієтою, і не було ніякого ефекту від статі.

Експресія мРНК OGG1 та ERCC1 щодо 18S у лейкоцитах, виділених із цільної крові (середнє значення та SD із числом суб'єктів у дужках) a, b

Співвідношення.

Не було значущої кореляції між 8-oxodG сечі та кінцевими точками аналізу комети, 8-oxodG сечі та експресією генів репарації ДНК, а також кінцевими точками аналізу комет та експресією генів репарації ДНК.

Обговорення

У цьому дослідженні ми виявили, що виснаження фруктів та овочів, або споживання 600 г фруктів та овочів, або відповідна кількість вітамінів та мінералів, що додаються як добавка протягом 24 днів, не змінили рівень розривів ниток, окислювальної ДНК базове пошкодження або чутливість до H2O2 в мононуклеарних клітинах крові. Вирази генів репарації ДНК, що беруть участь у відновленні базової ексцизії (OGG1) та відсіченні нуклеотидів (ERCC1), не змінювались спожитою дієтою, припускаючи, що незмінені рівні окисного пошкодження ДНК відбувалися не через зміну активності відновлення ДНК. Це поняття додатково посилюється незміненими виділеннями 8-оксидG із сечею, які представляють собою суму відновлення 8-оксидГ, санацію пулу нуклеотидів, оборот клітин та мітохондріальний обмін у всьому тілі (7). У сукупності наші дані настійно припускають, що надлишок окислювального пошкодження ДНК у суб'єктів не виникав у період низького споживання антиоксидантів.

На закінчення, це 24-денне випробування фруктів та овочів не показало сприятливого впливу на окисне пошкодження ДНК або експресію генів відновлення ДНК. Це може свідчити про те, що антиоксидантні властивості або вплив на окислювальне пошкодження ДНК відіграють незначну або зовсім не впливають на профілактичну дію раку фруктів та овочів. Як варіант, можливо, що суб’єкти, які брали участь у дослідженні, не зазнавали будь-якого типу окисного стресу, який міг би спричинити окислювальну шкоду. Крім того, слід взяти до уваги, що суб'єкти, обрані для дослідження, мали відносно високу звичну кількість споживаних фруктів та овочів і були некурящими. Необхідні додаткові дослідження щодо впливу фруктів та овочів на окислювальне пошкодження ДНК у ситуаціях окисного стресу, щоб підтримати роль фруктів та овочів у профілактиці раку.

Примітка додана в доказ.

Після подання цієї статті Коллінз та ін. (Carcinogenesis (Lond.) 24: 511–515, 2003) першими дослідниками були опубліковані дані про експресію мРНК OGG1 щодо споживання плодів ківі.