Материнське харчування модулює розвиток плода, викликаючи зміни ефективності плаценти у свинях

Анотація

Передумови

Обмеження внутрішньоматкового росту (IUGR) та заростання плода збільшують ризики для здоров’я після пологів. Харчування матері є головним внутрішньоутробним фактором навколишнього середовища, який змінює вагу плода. Однак механізми, що лежать в основі впливу материнського харчування на розвиток плода, не зовсім зрозумілі. Ми розробили модель свині, і використовуючи ізобаричні мітки для відносної та абсолютної кількісної оцінки (iTRAQ), ми досліджували зміни в плацентарному протеомі свинок при дієті з нормальним споживанням енергії (Con) та високим споживанням енергії (HE).

Результати

У групі Con важкі та легкі плоди були виявлені на маткових та шийних кінцях матки відповідно на 90 дні гестації. Більше того, важкі плоди мали вищу концентрацію глюкози, ніж легкі. Однак вища однорідність була відзначена у групі ВІН. Плацентарні промотори між цими двома положеннями вказували на те, що в групах Con та HE виявлено 78 та 50 диференційовано експресованих білків. У групі Con ці білки брали участь у ліпідному обміні (HADHA, AACS, CAD), транспорті поживних речовин (GLUT, SLC27A1) та енергетичному обміні (NDUFV1, NDUFV2, ATP5C1). Однак у групі ВІН вони в основному брали участь у транскрипційній та поступальній регуляції та внутрішньоклітинному везикулярному транспорті.

Висновки

Наші висновки показали, що материнське харчування може змінювати вагу при народженні головним чином за рахунок модуляції ліпідного та енергетичного обміну плаценти, що також забезпечує можливий механізм пояснення вищої однорідності ваги плода у свинок, які харчуються раціоном із ВН.

Передумови

Порівняно з вівцями та гризунами, свині фізіологічно та генетично більше схожі на людей [11], і тому їх розглядають як ідеальну модель для вивчення клінічного харчування [12]. Деякі дослідження на моделях свиней показують, що негативним ефектом аномального росту плода є те, що він сприяє більшим варіаціям ваги народжених поросят (CVBW0) в межах сміття [13]. Цікаво, що Кім та ін. (2013) резюмували, що вага плода лінійно зростала від шийки матки до матково-маткового з'єднання на 102 та 112 день гестації [14]. Таким чином, за допомогою свинячої моделі дослідження ефективності плаценти, яка розташована по обидва боки від маткового рогу, ймовірно, відображатиме основні механізми розвитку плода, які мають відношення до захворюваності на IUGR та надлишкової ваги потомства. Новонароджені із занадто низькою або високою вагою при народженні були загальною проблемою для здоров'я людини, хоча люди, як правило, належать до класифікації однородних тварин [15].

Більшість досліджень на тваринах продемонстрували, що споживання їжею матері під час гестації впливає на вагу при народженні [16, 17]. Тим не менше, механізми, що лежать в основі процесів, за допомогою яких материнське харчування регулює розвиток плода, залишаються незрозумілими. Отже, це дослідження досліджувало молекулярні основи коливань ваги новонароджених, спричинених різним рівнем споживання енергії матір’ю під час гестації. Використовуючи свинячу модель, ми досліджували пов'язані фактори, використовуючи аналіз протеомів плаценти з ізобарними мітками для відносної та абсолютної кількісної оцінки (iTRAQ). Наші результати дадуть нове розуміння для кращого розуміння молекулярних основ регуляції харчового розвитку матері через плаценту.

Методи

Управління тваринами та експериментальний дизайн

Дослідження на тваринах проводились відповідно до закону про захист тварин, затвердженого Комітетом з питань догляду та використання сільськогосподарських тварин Січуанського сільськогосподарського університету. У цьому експерименті було використано 28 чистопородних великих білих (GW) свинок із середньою вагою 135,54 ± 0,66 кг. Після спаровування свинки випадковим чином розподіляли на дві експериментальні групи. Дієтичні процедури включали два рівні дієтичного харчування з різною концентрацією добавки до соєвої олії: 14,23 МДж DE/кг (ВІН) та 12,56 МДж DE/кг (Con) рекомендованих енергетичних потреб NRC (2012) (Таблиця 1) . Споживання корму гестаційними свинями становило 2,0 кг/добу від d 0 до 30, 2,4 кг/добу від d 31 до 90 і 3,0 кг/добу від d 91 до опоросу. Усі підсвинки розміщувались в індивідуальних загонах для годування, а вода забезпечувалась за бажанням.

Збір зразків

Вимірювали товщину задніх жирів золоток (Р2: 65 мм від середньої лінії на останньому ребрі). З кожної групи випадковим чином було обрано чотири свині для забою на 55 і 90 гестаційні періоди відповідно, після глибокої анестезії Zoletil 50 (Zoletil 50 Vet, Virbac, Франція), у дозі 0,1 мг/кг маси тіла, введеної внутрішньом’язово ін’єкційно, залишилися свинки годували до пологів. Після лапаротомії матки негайно виймали з назовні і клали на лід. На 90 день гестації з кожного плода збирали пуповинну венозну кров, яка розташовувалась у напрямку до шийки матки та матково-трубочного з’єднання. Всі зразки крові центрифугували відразу після забору (3000 × g протягом 15 хв при 4 ° C). Для подальших аналізів зразки сироватки відбирали та зберігали при -20 ° C. Ваги плодів, розташованих у кожному матковому розі, від шийки матки до матково-трубочного з’єднання, реєструвались на 55 і 90 гестацій. Плаценти ретельно ізолювали і зважували з матки кожного плоду на 55 і 90 роках вагітності. На 90-му терміні гестації зразки тканини плаценти, які оточували шийку матки та матково-матковий зв’язок, швидко заморожувались у рідкому азоті після промивання холодним стерильним сольовим розчином для подальших експериментів.

Аналіз сироваткового IGF-1 та глюкози

IGF-1 у сироватці крові та глюкозу вимірювали за допомогою наборів для імуноферментного аналізу (R&D Systems Inc., Міннеаполіс, Міннесота, США), відповідно до рекомендацій виробника. Мінімальні виявлені рівні IGF-1 та глюкози становили 0,01 нг/мл.

Підготовка зразка білка

Кількісний підхід до протеоміки iTRAQ. Цей малюнок описує різне розташування збору зразків плаценти в матці між групою Con та групою HE. І основний процес протеомічного підходу iTRAQ

Аналізи протеоміки плаценти

LC-ESI-MS/MS аналіз на основі потрійного TOF 5600

Протокол аналізу РС був описаний раніше [22] з невеликими змінами. Спочатку кожну фракцію ресуспендували в буфері А (5% ACN, 0,1% FA) і центрифугували при 20000 × g протягом 10 хв, а кінцева концентрація пептиду становила приблизно 0,5 мкг/мкл. Згодом 10 мкл супернатанту завантажували у 2-сантиметрову пастку C18 колонки LC-20 AD nanoHPLC насосної системи (Shimadzu, Кіото, Японія). Пептиди елюювали на 10-сантиметрову аналітичну колонку С18 (внутрішній діаметр 75 мкм), упаковану в приміщенні. Зразки завантажували зі швидкістю 8 мкл/хв протягом 4 хв, потім градієнт починався з 300 нл/хв, від 2 до 35% В (95% ACN, 0,1% FA) протягом 35 хв, лінійний градієнт до 60% протягом 5 хв., 80% протягом 2 хв, технічне обслуговування протягом 4 хв і, нарешті, повертається до 5% за 1 хв. Фракції аналізували за допомогою системи TripleTOF 5600 (AB SCIEX, Concord, ON) з джерелом Nanospray III (AB SCIEX, Concord, ON) та витягнутим кварцовим наконечником як випромінювачем (New Objectives, Woburn, MA). Дані були отримані за 250 мс, і було зібрано до 30 сканувань іонів продукту, якщо було перевищено поріг 120 відліків в секунду (відліків/с), із зарядом від 2+ до 5+ та динамічним виключенням 15-ти с. налаштування. Кожну фракцію аналізували за допомогою нано LC-MS/MS, як описано раніше [23].

Обробка даних та аналіз

MRM-перевірка диференційовано експресованих білків з iTRAQ

Спектральна бібліотека даних MS/MS була сформована на TripleTOF5600 (AB SCIEX, Фостер-Сіті, Каліфорнія) та проведена пошук у базі даних свиней (48278 записів) за допомогою Mascot 2.3.02 (Matrix Science, Великобританія). Файл дати було імпортовано в програмне забезпечення Skyline, де була побудована бібліотека. Пептиди були відібрані для розробки методу множинного моніторингу реакцій (MRM) відповідно до таких критеріїв: (1) пептиди з унікальними послідовностями в базі даних; (2) максимум m/z 5-іонів з однаковим профілем елюції знаходився в тих же співвідношеннях, що і спектральна бібліотека. Прогнозований час утримання цільових пептидів спостерігали за стратегією IRT. Об’єднані пептиди перетравлювались та використовували попередній аналіз SRM для визначення місця виявлення цих білків.

Статистичний аналіз

Результати репродуктивних показників та дані біохімічних показників сироватки крові були проаналізовані за допомогою Стьюдента т-тест у SPSS (v. 19.0 для Windows, SPSS; компанія IBM SPSS, Чикаго, Іллінойс, США). Варіації ваги плода та поросят були проаналізовані після перетворення квадратного кореня арксинуса. Результати з стор

Результати

Відтворна здатність свинок

Дієтичне лікування матері не впливало на товщину заднього жиру в положенні Р2, вагу плода та коефіцієнт варіації ваги (CV вага) на 55 день гестації (таблиця 2; стор > 0,05). Однак на 90-й день гестації свині мали більшу товщину заднього жиру в позиції Р2 у групі ВІН, ніж у групі Con (стор Таблиця 2 Вплив рівня дієтичної енергії на репродуктивні здатності свинок

Розподіл ваги плода та плаценти (g) в межах рогу матки. a: розподіл ваги плода в групі Con на 55 день гестації; b: розподіл ваги плаценти в групі Con на 55 день гестації; c: розподіл ваги плода в групі ВІН на 55 день гестації; d: розподіл ваги плаценти у групі ВІН на 55 день гестації; e: розподіл ваги плода в групі Con на 90 день гестації; f: розподіл ваги плаценти в групі Con на 90 день гестації; g: розподіл ваги плода в групі ВІН на 90 день гестації; h: розподіл ваги плаценти у групі ВІН на 90 день гестації. Дані представлені як медіана (міжквартильний діапазон)

Концентрація IGF-1 та глюкози в сироватці плода в різних місцях матки

На 90-й день гестації концентрація IGF-1 та глюкози в групі Con була значно вищою у плодів, розташованих у напрямку до матково-трубочного з’єднання, ніж до шийки матки (стор 0,05) (таблиця 3; додатковий файл 2: таблиця S2).

Ідентифікація та порівняння білків диференціальної чисельності

За допомогою аналізу iTRAQ було виявлено в цілому 3011 та 3018 білків із коефіцієнтом помилкового виявлення 1% у різних місцях матки груп Con та HE (Додатковий файл 3: Таблиця S3; Додатковий файл 4: Таблиця S4).

З ідентифікованих білків у групі Con 78 виявили> 1,2-кратні зміни між шийкою матки та матково-трубочним з'єднанням (стор Таблиця 4 Диференціально експресовані білки в плаценті у групі Con

Функціональна класифікація білків диференціальної чисельності, ідентифікованих із плаценти. На панелях представлені репрезентативні цифри, отримані з a: група Con і b: група ВІН

З ідентифікованих білків у групі ВІН 50 показали> 1,2-кратні зміни між шийкою матки та матково-трубочним з'єднанням (стор Таблиця 5 Диференціально експресовані білки в плаценті в групі ВІН

Анотації GO до білків різного ряду

Аналіз розподілу GO диференційовано експресованих білків у плаценті. a: «клітинний компонент» групи Con; b: «клітинний компонент» групи ВІН; c: "молекулярна функція" групи Con; d: "молекулярна функція" групи ВІН; e: «біологічний процес» групи Con; f: «біологічний процес» групи ВІН

Валідація MRM для диференційовано експресованих білків з iTRAQ

MRM-аналіз успішно виявив 10 диференційовано експресованих білків (табл. 6), включаючи 20 унікальних пептидів із iTRAQ. Важливо, що логарифмічні співвідношення кількісних даних 10 цільових білків із MRM суттєво позитивно корелювали з даними з iTRAQ (рис. 5; стор 1.2, стор Таблиця 6 MRM-перевірка диференціально експресованих білків у групах Con та HE

Кореляція зміни складки між iTRAQ та MRM для десяти цільових білків. a: кореляція групи Con; b: кореляція групи ВІН

Обговорення

Диференціальне дослідження протеомів між плацентою в напрямку положення шийки матки та матково-трубочного з'єднання у групі Con

Диференціальне дослідження протеомів між плацентою в положенні шийки матки та матково-матковим з'єднанням у групі ВІН

Висновок

Наше дослідження наводить перші докази зміни у відповіді протеом на матково-трубному та шийному кінці плаценти на підвищене споживання дієтичної енергії під назовні. Ліпідний та енергетичний метаболізм плаценти та транспорт поживних речовин можуть мати вирішальне значення для впливу на вагу плодів. Крім того, це дослідження продемонструвало, що високоенергетичне постачання під час гестації посилювало розвиток плода, покращувало надходження плацентарних поживних речовин та зменшувало коливання ваги при народженні в посліді, зрештою, збільшуючи масу плода та рівномірність ваги поросят при народженні. Ці результати дають нове розуміння механізмів, за допомогою яких материнське харчування регулює ріст плода, та покращує наше розуміння ефективності плаценти.