LINC00116 кодує мітохондріальний пептид, що пов’язує дихання та ліпідний обмін

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: mikhail.vyssokikh @ gmail.competya @ genebee.msu.ru

Відредаговано Ігорем Уліцьким, Інститут науки Вейцмана, і прийнято членом редакційної ради Девідом Дж. Мангельсдорфом 28 січня 2019 р. (Отримано на огляд 7 червня 2018 р.)

Значимість

Короткі пептиди кодуються в геномах усіх організмів і виконують важливі функції. Через невеликий розмір таких відкритих рамок для читання, їх часто не помічають автоматичні анотації генома. Ми дослідили ген, який був помилково анотований як довга некодуюча РНК LINC00116, і продемонстрували, що цей ген кодує 56-амінокислотний пептид Mtln, який локалізований у мітохондріях. Інактивація кодуючого гена Mtln призводить до зменшення споживання кисню, пов'язаного з активністю дихального комплексу I, і порушує ліпідний склад клітини. Цей вплив опосередковується взаємодією Mtln із НАДН-залежною цитохром b5-редуктазою. Порушення мітохондріальної локалізації останніх фенокопій інактивації Mtln.

Анотація

Гени, що кодують малі пептиди, часто помиляються як неналежні гени РНК (lncRNA). Тут ми продемонстрували, що одна така транскрипція перетворена на пептид довжиною 56 амінокислот, що зберігається в хордових клітинах, що підтверджує роботу, опубліковану під час розгляду цієї рукописи. Пептид Mtln можна виявити в мітохондріях клітинних ліній і тканин миші. Відповідно до його мітохондріальної локалізації, відсутність Mtln зменшує активність комплексу дихальних ланцюгів мітохондрій I. На відміну від інтегральних компонентів та факторів складання NADH: убихінону оксидоредуктази, Mtln не змінює безпосередньо свою ферментативну активність. Взаємодія Mtln із NADH-залежним цитохром b5-редуктазою стимулює функціонування комплексу I, швидше за все, забезпечуючи сприятливий ліпідний склад мембрани. Вивчення Mtln висвітлює важливість малих пептидів, гени яких часто можуть бути помилково позначені як lncRNA, для контролю життєво важливих клітинних процесів.

Багато дрібних пептидів локалізовано в мітохондріях - органелі, основними функціями якої є дихання, пов'язане з продукцією АТФ, гомеостаз Са 2+, підтримка клітинного окисно-відновного потенціалу, синтез стероїдів, гему, кластерів FeS, індукція апоптозу та багато інших, нарешті, контроль доля клітини та функціональна цілісність тканин (15). Мітохондріальний протеом ссавців складається з понад 1100 білків (16), 5% від цієї кількості становлять невеликі білки довжиною менше 100 амінокислот (17). І мітохондріальні (18, 19), і ядерні геноми кодують короткі мітохондріальні пептиди, які є невід'ємними компонентами комплексів окисного фосфорилювання (OXPHOS) (17) або їх факторів складання (20), і відіграють значну роль у довголітті (21), стійкості до інсуліну (19) та модуляція апоптозу (18). Мутації в генах, що кодують малі пептиди, що мешкають у мітохондріях, можуть мати патологічні наслідки, такі як мітохондріальні енцефаломіопатії (22) та хвороба Лі (23).

Тут ми описуємо мишачий пептид, кодований геном, помилково позначеним як 1500011k16Rik lncRNA, що відповідає людському LINC00116. Пептид знаходиться в мітохондріях і є важливим для діяльності комплексу дихальних ланцюгів I. Після нашого першого звіту про функцію цього пептиду на конференції (24) і в той час як цей рукопис переглядався, дві групи опублікували подібні висновки щодо функціональної ролі цей пептид (25, 26), названий Міторегулін, Mtln.

Результати

Аналіз потенціалу кодування 1500011k16Rik.

Багато lncRNA містять передбачувані ORF, що трапляються випадково і не перекладаються у функціональний пептид. Мишача транскрипція 1500011k16Rik містить 56-амінокислотну ORF із передбачуваним однопрохідним трансмембранним сегментом (27), але не будь-який виявляється відносний домен. Кілька характеристик послідовності вказують на потенціал кодування. Аналіз збереження нуклеотидів генів, гомологічних 1500011k16Rik (рис. 1А), серед 60 видів хребетних (28), показав, що область передбачуваного ORF є найбільш і майже єдиною збереженою областю гена. Аналіз узагальнених даних профілювання рибосом (29) виявив значне покриття рибосомою передбачуваного ORF (додаток SI, рис. S1A). Вирівнювання передбачуваних продуктів трансляції ORF виявило високий ступінь збереження на рівні амінокислот (рис. 1B) з високим співвідношенням синонімів над несинонімічними кодоновими замінами та відсутністю передчасних стоп-кодонів у кадрі (Додаток SI, рис. B і C). В результаті ми дійшли висновку, що транскрипція 1500011k16Rik, швидше за все, буде перетворена в пептид довжиною 56 амінокислот, який ми будемо називати Міторегулін (Mtln) (25) для узгодженості в науковій літературі.

Аналіз збереження Mtln. (A) Область геному миші, що охоплює ген 1500011k16Rik. Показані екзони та місцезнаходження ORF. Діаграма збереження хребетних (28) показана під картою. (B) Вирівнювання послідовностей пептидів Mtln у хребетних.

Кодований пептид 1500011k16Rik експресується та локалізується в мітохондріях.

1500011k16Rik кодує новий поліпептид. (A) Конфокальні зображення mCherry-міченого пептиду Mtln; мітохондрії фарбували MitoTracker Green FM, а ядра Hoechst 33342. (Шкала шкали, 10 мкм.) (B) Імуноблотування ізольованих мітохондрій з NIH 3T3 та лізатів клітин із клітин NS0 для ендогенного Mtln. Tom20 та β-актин використовували як контроль навантаження. TMtln -1, -2, -3 - це різні нокаути для клітинної лінії NIH 3T3. (C) Імуноблотування лізатів органів миші для ендогенних Mtln. PARK7 використовувався як контроль навантаження (67).

Респіраторний комплекс I Передача електрону погіршується в клітинних лініях нокауту.

Щоб перевірити вплив Mtln на дихання мітохондрій, ми порівняли клітини NIH 3T3 та NS0 з їх похідними з інактивованим геном 1500011k16Rik, що кодує Mtln (додаток SI, рис. S2A). Розподіл клітин з високим і низьким мітохондріальним мембранним потенціалом перевіряли за допомогою співвідношення флуоресцентного барвника JC-1 та аналізу FACS. Рівень загальної продукції активних видів кисню (АФК) у клітинах дикого типу та мутантних клітинах оцінювали за допомогою аналізу FACS за допомогою 2 ′, 7 ′ –дихлорфлуоресцину діацетату (DCFDA). На відміну від результатів Stein et al. (25) ми не бачимо суттєвої різниці між клітинами дикого типу та нокаутом у виробництві АФК разом із мембранним потенціалом (Додаток SI, рис. S4 A та B).

Mtln взаємодіє з Cyb5r3. (A) Імунопреципітація HA-Mtln з клітин NIH 3T3 з подальшим імуноблотінгом антитілами проти Mtln (вгорі) та антитілами проти Cyb5r3 (знизу). Клітини, що експресують Mtln без мітки, використовували як контроль. (B) Активність комплексів I – IV у мутантних клітинах Cyb5r3 (Gly2 до Ala2) (∆Cyb5r3mito). Значення є середніми для чотирьох незалежних експериментів, проведених у трьох примірниках. Для статистично значущих змін величина P, скоригована на множинність (Р + Баланс.

Знижений внесок NADH: убіхінон оксидоредуктази у дихання мітохондрій може пояснюватися меншою швидкістю регенерації NADH. Для оцінки впливу нокауту Mtln на баланс NADH/NAD + ми застосували датчик флуоресцентного білка SoNar (31). Ми виявили, що у стаціонарному стані нокаутовані клітини дикого типу та Mtln не демонструють жодної суттєвої різниці в цитоплазматичному балансі NADH/NAD + окислювально-відновного складу (додаток SI, рис. S9A). Крім того, ми вирішили оцінити динаміку змін окислювально-відновного балансу в цитозолі, на який впливають різні метаболічні субстрати (Додаток SI, рис. S9 B і C). Тест виявив відсутність різниці в динаміці NADH/NAD + між батьківськими та Mtln-виснаженими клітинами. Можна зробити висновок, що на цитозольний окисно-відновний баланс абляція Mtln не впливає.

Як впливає Mtln на Cyb5r3?

Часто утворення білкового комплексу необхідно для стабілізації компонентів проти протеолізу. Однак це не стосується взаємодії Cyb5r3 з Mtln, як виявлено шляхом імуноблотингу Cyb5r3 у клітинах, що вибивають Mtln (додаток SI, рис. S10A). Щоб оцінити будь-який можливий вплив Mtln на локалізацію Cyb5r3, ми використовували клітинні лінії, що екктопічно експресують злитий білок Cyb5r3-eGFP. Локалізація злитого білка Cyb5r3 виявилася мітохондріальною як у батьківській клітинній лінії NIH 3T3, так і в його похідному, позбавленому пептиду Mtln (Додаток SI, рис. S10B). Більше того, ми не спостерігаємо різниці в рівні Mtln або локалізації при мутації yCyb5r3mito (Додаток SI, рис. S10 C і D).

Cyb5r3 каталізує окисно-відновну реакцію з декількома різними субстратами, тоді як він використовує лише NADH як донор електрона, який є одним з основних споживачів цитозольного NADH (32). Щоб перевірити вплив Mtln на здатність Cyb5r3 окислювати NADH, ми вимірювали його активність NADH-дегідрогенази в реакції з K3 [Fe (CN) 6] як фальшивий акцептор електронів (Додаток SI, рис. S10E). Встановлено, що здатність Cyb5r3 виділяти електрон з NADH не залежить від присутності Mtln.

Двома основними процесами, які потребують мембранної форми Cyb5r3, є десатурація жирних кислот Δ 9 (33) та біосинтез холестерину (34). Для оцінки впливу Mtln на активність Cyb5r3 в метаболізмі ліпідів ми провели LC-MS аналіз клітинних ліній NIH 3T3 та NS0, дефіцитних у Mtln. Ми кількісно оцінили понад 1000 ліпідів у кожній клітинній лінії (матеріали та методи). Кількості сотень ліпідів були значно і відтворювані (Додаток SI, рис. S11A) після виснаження Mtln у двох незалежно продукованих NIH 3T3 клітинних лініях з вибиванням. Більшість гліцероліпідів надмірно представлені, тоді як більшість гліцерофосфоліпідів є недостатньо представленими після нокауту Mtln як у клітинних лініях NIH 3T3, так і NS0 (рис. 5А).

Зміни концентрації ліпідів, спричинені порушенням локалізації мітохондрій Cyb5r3 (∆Cyb5r3mito). Зв'язок між log2-кратними змінами, спричиненими нокаутом Mtln (вісь x), та мутантом ∆Cyb5r3mito (вісь y) порівняно з диким типом. Кожна точка представляє один ліпід, гліцероліпіди (GL), гліцерофосфоліпіди (GP), а інші класи ліпідів позначені червоним, синім та чорним відповідно. Найменша квадратна лінія регресії показана червоним кольором. Коефіцієнт кореляції Пірсона, його 95% довірчий інтервал і значення P (тест t) показані у верхньому лівому куті.

Обговорення

Асортимент коротких пептидів, кодованих у геномах вищих організмів, таких як миша та людина, може складати майже пропущений шар регуляторних молекул (11, 35, 36). У цій роботі ми додали список малих функціональних пептидних утворень чудовим членом, мітохондріальним пептидом Mtln, відповідно до результатів інших груп (25, 26), опублікованих під час розгляду цієї роботи. Mtln є висококонсервативним у хребетних і, як видно з наших результатів, функціонує в клітинному метаболізмі.

Більшість малих пептидів виявляють свої функції, зв'язуючись з білком-партнером або будучи складовою частиною мультипротеїнових комплексів (10), як було показано для сарколіпіну та фосфоламбану (37, 38), гуманіну (18), Toddler/ELABELA (39, 40 ) та DWORF (41). Лише кілька невеликих пептидів мають окремі ферментативні функції, такі як 4-оксалокротонаттаутомераза, мономер якої містить лише 62 амінокислоти (42). Відповідно до цієї тенденції ми продемонстрували, що пептид Mtln взаємодіє з NADH: цитохром b5-оксидоредуктаза 3 (Cyb5r3). Порушення мітохондріальної локалізації останнього призводить до того самого фенотипу, що і виснаження Mtln, щодо дихального комплексу, який я пояснював споживанням кисню та зміною складу ліпідів. Таким чином, Mtln може функціонувати шляхом стимуляції активності Cyb5r3 в мітохондріях, необхідної для підтримки ліпідного гомеостазу. Недавнє дослідження продемонструвало, що Mtln може також взаємодіяти з іншими білками мітохондрій (26), такими як HADHA та HADHB, які беруть участь у β-окисленні жирних кислот. Хоча конкретні партнери з взаємодії Mtln визначені в нашому дослідженні та в роботі Makarewich et al. (26) різні, обидва вони пов'язані з пов'язаними процесами, що може свідчити про участь Mtln в метаболізмі жирних кислот із особливостями тканинного або клітинного типу.

Як ми показали, ця активність необхідна для функціонування дихального комплексу I в контексті мітохондріальної системи OXPHOS, але не для активності NADH-оксидази ізольованого комплексу I або комплексів I + III. Це спостереження відповідає спостереженню Stein et al. (25), демонструючи вплив дефіциту Mtln на формування суперкомплексів дихальних ланцюгів, що містять ДІ, але не на збірку ДІ та асоціацію комплексів ДІ та ХІІІ.

Кілька функцій приписували Cyb5r3. Окрім специфічної для еритроцитів активності метгемоглобінредуктази розчинної ізоформи Cyb5r3 (43), яка навряд чи буде актуальною для нашого дослідження, прив'язаний до мембран Cyb5r3 причетний до знежирення жирних кислот (33), біосинтезу холестерину (34), амідоксимової системи, яка бере участь у ліпогенезі (44 ⇓ –46) та метаболізмі ліків.

Матеріали та методи

Конструкції для інактивації генів та редагування геному були створені на основі плазміди pX458 (59). Конструкції Нокіна були створені на основі векторів транспозона Сплячої Красуні (60, 61). Моніторинг продукування АФК у приклеєних та суспензійних клітинах проводили згідно з протоколом, запропонованим Wojtala et al. (62). Норми споживання кисню вимірювали, як описано (63). Мітохондрії з культивованих клітин виділяли диференціальним центрифугуванням. Ферментативну активність Cyb5r3 визначали в ізольованих мітохондріях шляхом моніторингу NADH-залежного зменшення ферриціанідів (64). Екстракцію метаболіту для аналізу ліпідів проводили, як описано (65). Нецільове профілювання ліпідів проводили в режимі позитивної іонізації (66). Робота над тваринами була схвалена Комітетом з етики тварин у МДУ ім.

Детальніше про методологію дослідження наведено в Додатку SI.

Подяки

Ми дякуємо Алексу Лебедєфу за допомогу в редагуванні рукопису; Ксенії Смірновій за допомогу у вирощуванні клітин; Микола Аніканов та Олена Стекольщикова для екстракції ліпідів та вимірювання мас-спектрометрії для клітинних ліній подвійного вибивання; і доктору І Ян за надання векторів pcDNA3.1-SoNar та pcDNA3.1-iNapC. A.C. дякує Boehringer Ingelheim Fond за грант на подорож для відвідування курсу Європейської лабораторії молекулярної біології. Ми також дякуємо Інституту науки і технології "Сколково" за фінансування витрат на публікацію та плату за відкритий доступ. Ця робота була підтримана грантами Російського фонду фундаментальних досліджень (RFBR) 17-04-01904 та 18-29-07005 (для P.S. та A.C.); Грант Російського наукового фонду (RSF) 17-75-30027 (для P.S.) на роботи, пов'язані з редагуванням геному; і наукової школи МДУ (О.Д.). Експерименти на мишах були підтримані грантом Міністерства науки Росії 14.W03.31.0012. П.В. була підтримана стипендією Президента (SP-4132.2018.4). Робота з видалення Mtln не змінює цитозольний баланс NADH/NAD + була підтримана грантом RSF 17-15-01175 (для D.B.) та грантом RFBR 18-54-74003 (для V.B.).

Виноски

↵ 1 Кому може бути адресована кореспонденція. Електронна адреса: mikhail.vyssokikhgmail.com або petyagenebee.msu.ru .

Внески авторів: A.C., P.K., M.V., P.S. та O.D. розроблені дослідження; A.C., E.L., A.M., T.N., D.B., P.V., M.M., A.G., M.S., P.P., M.R., A.V., V.B. та M.V. виконані дослідження; Д.Б., П.В., М.М., М.С., П.П., М.Р., А.В. та В.Б. внесли нові реагенти/аналітичні інструменти; A.C., P.M., A.M., D.B., P.V., M.M., P.P., M.R., W.M., A.V., V.B. та M.V. проаналізовані дані; та A.C., P.K., M.V., P.S. та O.D. написав роботу.

Автори не заявляють конфлікту інтересів.