Індуковане забороною ожиріння призводить до ановуляції та полікістозу яєчників у мишей

Судхарсана Рао Анде

1 Кафедра внутрішньої медицини, Університет Манітоби, Вінніпег, R3E 3P4, Канада

Ханх Хоа Нгуєн

1 Кафедра внутрішньої медицини, Університет Манітоби, Вінніпег, R3E 3P4, Канада

Ян Сінь Цзи Сю

1 Кафедра внутрішньої медицини, Університет Манітоби, Вінніпег, R3E 3P4, Канада

Суреш Мішра

1 Кафедра внутрішньої медицини, Університет Манітоби, Вінніпег, R3E 3P4, Канада

2 Кафедра фізіології та патофізіології, Університет Манітоби, Вінніпег, R3E 0J9, Канада

АНОТАЦІЯ

ВСТУП

РЕЗУЛЬТАТИ

Ожиріння у самок мишей Mito-Ob призводить до зниження плодючості, утворення кісти яєчника та безпліддя

Нещодавно ми повідомили про нову модель трансгенної ожирілої миші (Mito-Ob), розроблену шляхом надмірного експресії пробігіну в адипоцитах (Ande et al., 2014). У віці 6 місяців миші Mito-Ob мали значно більшу масу тіла, що відображається збільшенням маси вісцеральної та підшкірної жирової тканини з гіпертрофованими адипоцитами (Ande et al., 2014). Під час подальших досліджень на мишах Mito-Ob ми помітили значне зниження плодючості із старінням порівняно з мишами дикого типу, а самки мишей Mito-Ob були безплідними до 9-місячного віку (рис. 1 A). Спостереження за зниженою плодючістю та подальшою втратою плодючості у мишей з Міто-Об спонукали нас дослідити фенотип яєчників мишей з Міто-Об. У віці 9 місяців яєчники у ~ 25% мишей Mito-Ob були значно збільшені внаслідок утворення морфологічно очевидних кіст яєчників, наповнених серозною рідиною (рис. 1 Б), чого не спостерігалося в яєчниках дикорослих типу мишей. Кісти яєчників у мишей з Міто-Об часто розвиваються двосторонньо.

Гістологічний аналіз яєчників мишей Mito-Ob підтвердив утворення кісти яєчника (рис. 2 A, B). Крім того, яєчники були оточені надмірним розростанням жирової тканини та періоваріальної жирової тканини, тісно пов'язаної з поверхнею епітелію яєчників (рис. 2 А, В та 3). 3). Припинення розвитку фолікулів та зменшення кількості жовтого тіла, або їх відсутність, було очевидним у яєчниках мишей Mito-Ob (рис. 2 А, В та 3). 3). Зі збільшенням розміру кісти яєчника виявлено, що маса тканин яєчників відсувається в один бік і стискається в результаті значного збільшення кісти яєчника з одного боку та надмірного розростання жирової тканини яєчників з іншого боку (рис. 2 Б і і3 3).

Гістологічне фарбування, що показує зміни структури яєчників у мишей Mito-Ob та тісний зв’язок між яєчниками та жировою тканиною періоваріану. Репрезентативні мікрофотографії, що демонструють пофарбовані H & E зрізи яєчників мишей (A) Wt та Mito-Ob у віці 3 та 9 місяців, (B) безплідну мишу Mito-Ob у віці 9 місяців. Права панель показує збільшений вигляд області в коробці на лівій панелі (n = 6 мишей/групи). Ad, жирова тканина; Ов, яєчник; зірочка, кіста яєчника.

Гістологічне фарбування яєчників у безплідних мишей Mito-Ob, що демонструє тісний зв’язок між яєчниками та жировою тканиною періоваріану. Репрезентативні мікрофотографії яєчників 9-місячних мишей Mito-Ob, що показують кісти яєчників на різних стадіях їх розвитку. Для поліпшення візуалізації жирової тканини використовували синій фільтр. Права панель показує збільшений вигляд областей, розташованих у коробках, на лівій панелі. Стрілка вказує на сильно розширену стінку кісти яєчника; стрілка вказує на тісний зв’язок між поверхнею яєчника та жировою тканиною періоваріану (n = 6). Ad, жирова тканина; ХЛ, жовте тіло; Ов, яєчник; зірочка, кіста яєчника.

Ожиріння не впливає на гомеостаз глюкози та чутливість до інсуліну під час розвитку безпліддя у самок мишей Mito-Ob

Нещодавно ми повідомляли, що ожиріння у самок мишей Mito-Ob не впливає на гомеостаз глюкози та чутливість до інсуліну у віці 6 місяців (Ande et al., 2014). Щоб уникнути порівняння з попереднім дослідженням та визначити метаболічний статус під час безпліддя, пов’язаного з ожирінням, ми вимірювали гомеостаз глюкози у мишей Mito-Ob у віці 9 місяців. Ми не виявили відмінностей у толерантності до глюкози та інсуліну між мишами Mito-Ob та мишами дикого типу, що відповідають віку (рис. 4 A, ліворуч та праворуч). Відповідно до нормального гомеостазу глюкози та чутливості до інсуліну, ми не виявили суттєвих відмінностей у рівнях інсуліну натще та в сировині між мито-Ob та мишами дикого типу (рис. 4 B, зліва). Подібним чином рівень лептину та резистину не суттєво відрізнявся між мишами Mito-Ob та мишами дикого типу, тоді як рівні адипонектину були вищими у мишей Mito-Ob у порівнянні з мишами дикого типу (рис. 4 B, праворуч). У сукупності ці дані свідчать про те, що гомеостаз глюкози та чутливість до інсуліну залишаються нормальними під час ожиріння, пов’язаної з дисфункцією яєчників та безпліддям у мишей Mito-Ob.

Метаболічний фенотип та рівень гормонів у самок мишей Mito-Ob під час розвитку кісти яєчника. (A) Лінійні графіки, що показують тест на толерантність до глюкози (GTT, ліворуч) та тест на толерантність до інсуліну (ITT, праворуч), дають результат у 9-місячних мишей Mito-Ob у порівнянні з мишами Wt. Дані представлені як середнє значення ± s.e.m. (n = 6 мишей/група). (B) Гістограми, що показують рівні інсуліну натще і згодовування (ліворуч) та різні рівні гормонів (праворуч) у мишей Mito-Ob та Wt. Дані представлені як середнє значення ± s.e.m. (n = 6 мишей/група). NS, не значущий за t-критерієм Стьюдента між мишами Mito-Ob та Wt. МО, Міто-Об.

Рівень лютеїнізуючого гормону (ЛГ) та тестостерону залишаються нормальними під час розвитку кісти яєчника у мишей Mito-Ob

Гіперандрогенія та гіперінсулінемія вважаються важливими факторами, що сприяють розвитку СПКЯ у жінок (Restuccia et al., 2012). Отримані нами дані про нормальний рівень інсуліну та чутливість до інсуліну, а також ановуляцію та полікістоз яєчників у мишей Mito-Ob спонукали нас виміряти рівень ЛГ та тестостерону у самок мишей Mito-Ob. Ми не спостерігали суттєвих відмінностей у рівні ЛГ та тестостерону в сироватці між мишами Mito-Ob та мишами дикого типу (рис. 5), хоча рівні обох гормонів були меншими у мишей Mito-Ob, ніж у мишей дикого типу. У сукупності ці дані дозволяють припустити, що пов’язана з ожирінням дисрегуляція та безпліддя яєчників у мишей Mito-Ob розвиваються незалежно від гіперінсулінемії та високого рівня андрогену.

ОБГОВОРЕННЯ

Гіперандрогенізм є найбільш послідовною рисою жінок із СПКЯ (Abbott et al., 2002). Однак незрозуміло, чи є гіперандрогенія причиною або наслідком СПКЯ, хоча було розроблено ряд модельованих андрогеном тваринних моделей СПКЯ, що свідчить про те, що андрогени є важливим фактором у розвитку СПКЯ (ван Хаутен та Visser, 2014; Walters et al., 2012). У цьому контексті важливо відзначити, що такі ефекти андрогенів обмежуються певними стадіями процесу розвитку (van Houten and Visser, 2014). Оскільки джерело та терміни таких наслідків гіперандрогенії у розвитку СПКЯ у жінок не ясні, не можна виключати можливість андроген-незалежної етіології СПКЯ людини. Крім того, високі рівні андрогену, які зазвичай спостерігаються у пацієнтів із СПКЯ, можуть бути вторинними щодо розвитку СПКЯ. Наприклад, гіперінсулінемія може сприяти гіперандрогенії завдяки своїй дії на клітини тека у пацієнтів із СПКЯ. Полікістоз фенотипу яєчників мишей Mito-Ob відкриває можливість дослідити андроген-незалежний розвиток полікістозу яєчників.

На додаток до мишей Mito-Ob, нещодавно ми повідомляли про мутантну мишу Mito-Ob, яка аналогічно експресує фосфомутантну (Y114F) форму пробігібіну (Ande et al., 2016). Мутантні миші Mito-Ob поділяють ожиріння та метаболічний фенотип мишей Mito-Ob, але розвивають пухлини лімфатичних вузлів лише у чоловіків, що свідчить про захисну роль естрогену в метаболічній дисрегуляції та розвитку пухлини, пов’язаної з ожирінням (Ande et al., 2016) . Як припускали, виявлено, що оваріектомія у мишей-мутантів-міто-об’їв порушує метаболічну дисрегуляцію та розвиток пухлини лімфатичних вузлів (Ande et al., 2016), підтверджуючи захисну роль естрогену у цих мишей. Крім того, мутантні миші Mito-Ob демонструють ановуляцію та полікістоз яєчників, подібні до самок мишей Mito-Ob (S.M., неопубліковані дані). Розвиток полікістозу яєчників у мишей-мутантів Mito-Ob додатково підтверджує висновки мишей Mito-Ob, що надмірне зростання періоваріальної жирової тканини та підвищений рівень естрадіолу можуть спричинити порушення регуляції та безпліддя яєчників, включаючи полікістоз яєчників.

Передбачається, що описані тут спонтанні моделі ановуляції, пов’язаної з ожирінням, і полікістозу яєчників будуть цінними для вивчення основних механізмів, пов’язаних із ановуляцією, пов’язаною з ожирінням, та розладами яєчників. Таким чином, мишам Mito-Ob буде корисно розпізнати відносний внесок різних факторів, які спільно існують у захворюваннях яєчників, пов’язаних із ожирінням.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Покоління трансгенних мито-мишачих мишей

Породження трансгенних мишей Mito-Ob, що надмірно експресують пробігін в адипоцитах, було описано в іншому місці (Ande et al., 2014). Всі роботи над тваринами, про які повідомляється тут, виконувались згідно з протоколом дослідження, затвердженим Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при Університеті Манітоби, Канада. Для порівняння між мито-Ob та мишами дикого типу, самців мишей Mito-Ob вирощували з самками мишей CD-1 дикого типу, щоб генерувати гемізиготних мишей мито-об і мишей дикого типу з одного підстилки. Таким чином, контрольні миші дикого типу мали ідентичний генетичний фон як трансгенні миші Mito-Ob. Трансгенних мишей Mito-Ob ідентифікували шляхом генотипування хвостової ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з наступними праймерами: прямий праймер: 5′-GCAGCCCGGGGATCCACTA-3 ′ і 5′-GCACACGCTCATCAAAGTCCTCTCCGATGCTG-3 ′. Мишей міто-об і дикого типу містили невеликими групами з 12-годинними циклами темного світла та доступом до їжі та води за бажанням.

Західний імуноблотинг

Лізати матки та яєчників від мито-Ob та мишей дикого типу, що містять однакову кількість білків (15 мг/провулок), відокремлювали електрофорезом додецилсульфату натрію в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE), а потім аналізували імуноблотингом з використанням антитіл до протеїбіну Анде та ін., 2014).

Гістологія

Яєчники від 3- до 9-місячного мито-Ob та мишей дикого типу фіксували на ніч у 10% забуференному формальдегіді і згодом зневоднювали у градуйованій серії етанолу, перш ніж вкладати їх у парафін. П’ятимікронні зрізи яєчників вирізали та обробили для фарбування гематоксиліном та еозином (H&E) (Lei et al., 2001; Nguyen et al., 2011).

Вимірювання сироваткових гормонів та адипокіну

Рівні інсуліну та адипокіну в сироватці крові вимірювали за допомогою мишей Bio-Plex Pro ™ на діабетичні панелі та системи мультиплексних суспензійних масивів Bio-Plex 200 ™ (Bio-Rad) згідно з протоколами виробника (Ande et al., 2014, 2016). Рівні ЛГ (USBiological, Swampscott, MA, США) та статевих стероїдних гормонів (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) вимірювали за допомогою комерційно доступних наборів відповідно до протоколів, наданих виробником.

Тести на толерантність до глюкози та інсуліну

Тести на толерантність до глюкози та інсуліну у 9-місячних мишей Mito-Ob та їх відповідних одноліток дикого типу проводили відповідно до стандартних процедур, описаних у наших попередніх публікаціях (Nguyen et al., 2011; Ande et al., 2014).

Статистичний аналіз

Всі статистичні аналізи проводили за допомогою GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA, USA). Результати експерименту показані як середнє значення ± s.e.m. Двохвості неспарені t-тести Стьюдента були проведені для порівняння міто-обських та диких типів послідівників, якщо не вказано інше. P Виноски

Конкуруючі інтереси

Автори не заявляють жодних конкуруючих або фінансових інтересів.