Годування з високим вмістом жиру, а не ожиріння, зумовлює таксономічні та функціональні зміни мікробіоти кишечника у мишей

Анотація

Передумови

Загальновідомо, що мікробіота ожирених мишей з високим вмістом жиру (ВЧ) відрізняється від мишей з худими мишами, але в якій мірі ця різниця відображає стан ожиріння або дієта незрозуміла. Щоб відокремити зміни мікробіоти кишечника, пов’язані з високим ВЧ, від тих, що пов’язані з ожирінням, ми скористалися різною сприйнятливістю мишей C57BL/6JBomTac (BL6) та 129S6/SvEvTac (Sv129) до ожиріння, спричиненого дієтою, та їх різної реакції. до інгібування активності циклооксигенази (ЦОГ), де інгібування активності ЦОГ у мишей BL6 запобігає ожирінню, спричиненому ВЧ-дієтою, але у мишей Sv129 підсилює ожиріння.

Результати

Використовуючи секвенування цілого геному на основі HiSeq, ми виявили таксономічні та функціональні відмінності мікробіоти кишечника двох штамів мишей, які годували звичайними дієтами з низьким вмістом жиру або СН, з добавками або без інгібітора ЦОГ, індометацину. ВЧ-годування, а не розвиток ожиріння призвели до чітких змін мікробіоти кишечника. Ми спостерігали значне збільшення альфа-різноманітності, кількості генів, великої кількості родів, які, як відомо, є продуцентами бутиратів, і великої кількості генів, що беруть участь у виробництві бутирату, у мишей Sv129 у порівнянні з мишами BL6, які харчувались як LF, так і HF дієтою. І навпаки, велика кількість генів, що беруть участь у метаболізмі пропіонату, пов’язаних із збільшенням врожаю енергії, була більшою у мишей BL6, ніж у мишей Sv129.

Висновки

Зміни у складі мікробіоти кишечника були зумовлені переважно харчуванням з високим вмістом жиру, а не відображенням стану ожиріння мишей. Відмінності в великій кількості бактерій, що продукують бутират і пропіонат, в кишечнику можуть, принаймні, частково сприяти спостережуваним відмінностям у схильності до ожиріння у мишей Sv129 та BL6.

Передумови

Схильний до ожиріння штам мишей C57BL/6JBomTac (BL6) та стійкий до ожиріння штам мишей 129S6/SvEvTac (Sv129) є одними з найбільш часто використовуваних штамів для досліджень генетичного ожиріння та ожиріння. Ми показали, що інгібування активності циклооксигенази посилювало ожиріння, спричинене ВЧ, у мишей, стійких до ожиріння, мишей Sv129, зменшуючи термогенез, викликаний дієтою, та індукцію експресії UCP1 в паховій білій жировій тканині [22], тоді як інгібування активності циклооксигенази при нормальному ожирінні миші BL6 з профілактикою HF запобігали ожирінню, спричиненому ВЧ-годуванням [23].

Отримати подальше розуміння змін, пов’язаних з дієтою та ожирінням мікробіоти кишечника, та визначити, чи спостерігалися зміни внаслідок ожиріння чи ВЧ-годування, ми скористалися перевагами різної сприйнятливості цих двох штамів мишей до ожиріння, спричиненого дієтою, та їх різної реакції на пригнічення активності циклооксигенази. Наші результати вказують на те, що зміни мікробіоти кишечника значною мірою відображають ВЧ-годування, а не ожиріння.

Результати

Експериментальна установка та побудова еталонного набору метагеномів кишечника

Щоб відрізнити зміни мікробіоти кишечника, що виникають у відповідь на обезогенну дієту, від змін, обумовлених розвитком ожиріння, ми використали різну схильність мишей BL6 та Sv129 до розвитку ожиріння, спричиненого дієтою, та їхні різні реакції на лікування загальним інгібітором циклооксигенази індометацином . Мишей підтримували дієту з низьким вмістом жиру (LF) або годували HF дієтою, доповненою (HFI) чи ні (HF) індометацином. За погодженням із попередніми висновками [22], включення індометацину підкреслювало збільшення ваги, зумовлене дієтами, збільшення маси білої жирової тканини (WAT) та гіпертрофію у мишей Sv129 (рис. 1). Навпаки, добавки індометацину запобігали збільшенню ваги, маси ВАТ та гіпертрофії у мишей BL6, спричинених дієтою, з високим вмістом жиру (рис. 1) [23].

Індуковані дієтою та штам-залежні зміни мікробіоти кишечника

Аналіз основних координат на основі генів, родів та KO (PCoA) (рис. 2 та додатковий файл 3: рис. S2) вказав на вміст жиру в їжі як головний фактор розділення (PC1) та специфічні відмінності між штамами мишей Sv129 та BL6 як вторинний фактор розділення (РС2). Далі PCoA продемонстрував, що між мишами, що харчуються HF- та HFI, не було суттєвого розділення на основі профілів генів мікробіомів (рис. 2) та тестування підсумків рангових сум Вількоксона (додатковий файл 4: малюнок S3 та додатковий файл 5: Рисунок S4), незважаючи на чіткий вплив індометацину на розвиток ожиріння.

PCoA аналіз усіх зразків на основі генних профілів. різні кольори і фігури позначають зразки з різних підгруп, тоді як порожній, наполовину заповнений, і заповнені бали відповідають мишам, які характеризуються як «худі» або «без суттєвого збільшення маси жирової тканини (NSI)», і «значне збільшення маси жирової тканини (SI)». PCoA демонструє, як штам і дієта миші є головними рушіями для поділу на генному рівні

Тест PERMANOVA аналогічно продемонстрував, що дієта має більший вплив на мікробіоти кишечника, ніж штам, і важливо, що добавки індометацину не впливають суттєво на склад мікробіоти кишечника на рівні гена, рівні роду та рівні KEGG (Додатковий файл 6: Таблиця S2 ).

Повідомлялося, що ожиріння асоціюється із зменшенням кількості мікробних генів [11, 12]. У мишей, годуваних LF, кількість генів була значно вищою у мишей Sv129, ніж у мишей BL6 (рис. 3b). ВЧ-годування з добавками індометацину або без них збільшувало кількість генів в обох штамах. Таким чином, спостерігалося збільшення кількості генів у відповідь на ВЧ годування, незалежно від того, залишались миші худими або ожиріли. Слід зазначити, що після годування ВЧ не спостерігалось значної різниці в кількості генів між цими двома штамами (рис. 3б).

Споживання ВЧ-дієт спричиняло таксономічні зміни незалежно від деформації та ожиріння. Тест підсумку рангу Уілкоксона (P Рис.4

Мережа родів, що характеризують мишей Sv129 та BL6. зелені кола представляють роди, присутні в більшій кількості у мишей Sv129, ніж у BL6 та червоні кола у мишей BL6 більша кількість родів, ніж у Sv129. площа кола представляє відносну чисельність роду. суцільна лінія представляє позитивну кореляцію між двома родами, тоді як a пунктирна лінія являє собою негативну кореляцію

Аналіз шляхів КЕГГ рівня 1 виявив додаткові зміни, спричинені ВЧ-дієтою, незалежно від напруги та ожиріння. Відносна кількість КО, пов’язаних із клітинними процесами та інформаційними процесами навколишнього середовища, зросла після ВЧ дієтичного харчування, тоді як кількість КО, пов’язаного із загальним метаболізмом, зменшилась (Додатковий файл 4: Рисунок S3). Для подальшого аналізу порушених метаболічних шляхів ми використовували z бальний метод [32] для функціонального аналізу на рівні шляхів та модулів з подальшим детальним аналізом змін КО у кожному вибраному шляху та модулі. Незалежно від штаму миші, високочастотне годування збільшувало рясність генів, що беруть участь у шляхах і модулях, пов’язаних з метаболізмом жирних кислот, рухливістю клітин, транспортом, метаболізмом метану та деградацією ксенобіотиків, а також зменшення кількості генів, що беруть участь у трансляції та біосинтезі вітамінів. (Додатковий файл 16: Таблиця S4 та Додатковий файл 17: Таблиця S5).

Утилізація гліцеринової частини тригліцеридів необхідна для вилучення енергії з тригліцеридів у високодисперсних дієтах в анаеробному середовищі. Щоб дослідити, чи адаптується мікробіота кишечника до підвищеного використання гліцерину у відповідь на ВЧ-дієту, ми використовували KEGG та NCBI для пошуку ключового ферменту в утилізації гліцерину - гліцерол-кінази у найпоширеніших родах. Слід зазначити, що гліцеринкіназа була виявлена у 18 з 25 найбільш поширених родів (Додатковий файл 18: Таблиця S6). Більше того, більшість родів, що мають гени, що кодують гліцерол-кіназу, збагачувались на мишах, які харчувались ВЧ-дієтами, тоді як роди, які не могли використовувати гліцерин, збагачувались на мишах з дієтичним харчуванням з низьким вмістом жиру (Додатковий файл 18: Таблиця S6). Разом це свідчить про те, що підвищена здатність до використання гліцерину характеризує зміни ВЧ мікрофлори кишечника в обох штамах мишей, викликані дієтою.

Жовчні кислоти відіграють важливу роль у метаболізмі жиру в кишечнику, а ВЧ-годування може призвести до підвищеної потреби в 7α-дегідроксилюванні жовчної кислоти. Відповідно, читання класифікується як Clostridium scindens, Clostridium hiranonis, Clostridium hylemonae, і Clostridium leptum, всі, що повідомляють, прискорюють 7α-дегідроксилювання жовчних кислот [33, 34], були виявлені у більшій кількості після ВЧ-годування (додатковий файл 19: Рисунок S13). Крім того, відносна велика кількість Клострідій рід збільшився в обох штамах мишей у відповідь на ВЧ дієту (додатковий файл 5: Рисунок S4).

Обговорення

У мишей, які харчувались НЧ-дієтою, ми відзначали характерні відмінності між мишами Sv129 та BL6. Тоді як Фірма були в більшій кількості в Sv129, ніж у мишей BL6, Веррукомікроб було більше у мишей BL6, ніж у мишей Sv129. Дивно, але ми спостерігали, що відносна чисельність A. muciniphila, повідомлялося, що він підтримував функцію бар'єрного кишківника і пов’язаний із стійкістю до ожиріння, спричиненого дієтою [28], був нижчим у стійкого до ожиріння Sv129, ніж у мишей BL6 як на LF, так і на СН. Цей висновок підкреслює, що, хоча, як повідомляється, колонізація цією бактерією протидіє ожирінню, спричиненому дієтою [28, 44, 45], функція цієї бактерії цілком може залежати від конкретного середовища спільноти, на що також свідчать великі відмінності у відносному достаток A. muciniphila у зразках фекалій мишей, що утримуються в різних приміщеннях для утримання [15].

Вилучення енергії з тригліцеридів в анаеробному середовищі залежить від метаболізму гліцерину. Використовуючи KEGG та NCBI для пошуку ключових ферментів у використанні гліцерину в найбільш поширених родах, ми виявили, що гени, що кодують гліцеринкінази, ацилгліцерол-кіназу або діацилгліцерол-кіназу, були знайдені в 10 з 25 найпоширеніших родів, і 8 з цих родів збагачений мишами, котрі харчуються ВЧ-дієтами, тоді як роди, які не можуть використовувати гліцерин, збагачуються у мишей, які харчуються нежирною дієтою. Це свідчить про те, що така адаптація сприяє незалежним від штаму ВЧ-індукованим змінам мікробіоти кишечника. Подібним чином, ВЧ годування призвело до збільшення чисельності Клострідій Повідомляється, що види, що прискорюють 7α-дегідроксилювання жовчних кислот [33, 34], можуть бути пов’язані з необхідністю метаболізму жовчних кислот у відповідь на прийом дієти з високим вмістом тригліцеридів, але очевидно, що потрібна додаткова робота, щоб встановити, чи HF годування змінює жовч метаболізм кислоти.

Висновки

Методи

Тестові сполуки та дієти

Дієти з низьким вмістом жиру (контроль Ssniff EF R/M) та високим вмістом жиру (Ssniff EF R/M згідно D12492) були отримані від Ssniff Spezialdiäten GmbH (Німеччина). Дієта з низьким вмістом жиру (НЖ) містила 70 енергетичних (е)% вуглеводів, 20 е% білка та 10 е% жиру, а дієта з високим вмістом жиру (ВЖ) містила 21 е% вуглеводів, 19 е% білка та 60 е% жиру. Для ВЧ дієти, доповненої індометацином (HFI), в раціон було включено 0,0016 г/100 г.

Тварини та житло

Двадцять чотири самці мишей C57BL/6JBomTac та 30 самців мишей 129S6/SvEvTac, віком 10 тижнів, були отримані від Taconic (Ry, Данія). Усі миші були в індивідуальній клітці з підстилкою з тирси, утримувались у контрольованих умовах навколишнього середовища (температура 26 ± 0,5 ° C, 12/12-годинний цикл світло/темрява) та мали вільний доступ до корму та води.

Після 1 тижня акліматизації мишей кожного штаму поміщали у три групи (10 LF-, 10 HF- та 10 HFI-годували мишей Sv129; 7 LF-, 8 HF- та 9 HFI-годували мишей BL6) та годували цих різні дієти протягом 6 тижнів поспіль. Масу тіла реєстрували двічі на тиждень, а споживання корму реєстрували щотижня. У всіх мишей спостерігали принаймні двічі на день на предмет будь-яких відхилень у клінічному вигляді. Наприкінці експерименту мишам знеболювали ізофлураном (Isoba-vet, Schering-Plough, Данія) та евтаназували шляхом серцевої пункції. Відповідні жирові тканини негайно розтинали, зважували, швидко заморожували у рідкому азоті та зберігали при -80 ° C. Експеримент на тваринах був схвалений Національною державною комісією з біологічних експериментів з живими тваринами (Норвегія та Данія) та проведений відповідно до затверджених рекомендацій.

Вилучення ДНК

Перед закінченням відбирали проби свіжих калів і негайно заморожували при -80 ° C. Екстракцію ДНК проводили по 200 мг калу на зразок із використанням набору ґрунтового нуклеоспіну Macherey-Nagel. Екстракції проводили за протоколом набору, за винятком того, що лізис клітин проводили шляхом збивання зразків бісером двічі протягом 30 с з інкубацією протягом 2 хв на льоду між биттям бісером. Отримані концентрації геномної ДНК вимірювали за допомогою нанодропа, а цілісність ДНК досліджували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Метагеномне секвенування проводили із застосуванням HiSeq 2000 та 90-bp PE стратегії [24].

Складання De novo та прогнозування генів

Після видалення адаптерів було видалено неякісні зчитування та зчитування, які належать хосту, отримано 46 100 196 - 977 672 (середнє значення ± s.e.m.) високоякісних зчитувань. Потім ці високоякісні зчитування з 54 зразків були зібрані в контиги за допомогою SOAPdenovo (v1.06), використовуючи ті самі параметри, що були використані в каталозі генів MetaHIT [24]. Для кожної проби було отримано 53 226 ± 2097 (середнє значення ± s.e.m.) контигів довжиною 102 946 516 ± 2 678 730 bp (середнє значення ± s.e.m.). GeneMark (v2.7) був використаний для прогнозування відкритих кадрів зчитування (ORF).

Побудова посилання на метагеном кишечника

Щоб дослідити метагеномічну інформацію мікробіоти кишечника миші, ми спочатку створили метагеномічний каталог на основі зразків, отриманих у цьому дослідженні. Усі ORF, передбачені з 54 зразків, були об’єднані та вирівняні між собою за допомогою BLAT. Пари генів з ідентичністю понад 95% (не допускається розрив) та вирівняними зчитуваннями, що охоплюють понад 90% коротших зчитувань, були згруповані разом. Для представлення групи використовували найдовший ORF у кожній групі, а інші ORF групи розглядали як надлишкові послідовності. Потім ORF довжиною менше 100 п.н. відфільтровували. Нарешті, був побудований генний каталог, що містив 793847 непотрібних генів, який охоплював 77,4 ± 0,3% (середнє значення ± с.м.м.) високоякісних показань у кожній пробі.

На основі цього еталонного набору генів ми провели таксономічне присвоєння та функціональну анотацію, використовуючи базу даних NR (v3) та базу даних KEGG (випуск 59.0). У цьому дослідженні 80% генів у каталозі можуть бути надійно віднесені до бази даних NR, решта генів, швидше за все, були від невизначених на даний час мікробних видів. На функціональному рівні ми виявили 4846 ортологів KEGG (KO), що охоплюють 46,43% генів у каталозі.

Таксономічне присвоєння та функціональна класифікація

Нуклеотидні послідовності передбачуваних генів були переведені в білкові послідовності за допомогою генетичних кодів NCBI 11. BLASTp був використаний для проведення таксономічного розподілу та функціональної класифікації передбачуваних генів щодо бази даних NR (v3) та бази даних KEGG (випуск 59.0) з Е значення ≤1 × 10 −3. Всі гени шукали проти IMG (v3.4) за допомогою BALSTN, використовуючи параметри за замовчуванням, за винятком Е значенням було встановлено 1 × 10 −5. Таксономічну асоціацію гена вирішив найнижчий загальний предок з усіх його результатів таксономічних анотацій. Гени, анотовані KEGG, були призначені шляхам KEGG. Загалом ми ідентифікували 4846 КО у наборі еталонних генів із 80,0 та 46,4% генів еталонного набору генів, що мають таксономічну та функціональну інформацію відповідно.

Відносна кількість генів і KO

Високоякісні чисті парні зчитування з кожного зразка були вирівняні з контрольними генами, встановленими МИЛО2 використання критерію, що вимагає посвідчення особи> 90%. Ми підрахували лише кількість зчитувань, які відповідали наступним критеріям: (i) парні зчитування можна було відобразити на послідовність генів із помірним розміром вставки; (ii) Одне з парних зчитувань може бути відображене на кінці генної послідовності, тоді як інше зчитування відображається поза зоною гена. В обох ситуаціях відображені парні читання зараховувались як одна копія. Кількість зчитувань, зіставлених з певним геном, нормувалась за довжиною гена. Згодом була побудована таблиця відносної чисельності шляхом нормування суми всіх генів зразка до 1. У рівнянні (1), \ (_i \) позначає кількість зчитувань, які зіставлені з певним геном, та L i довжина цього гена, тоді відносна кількість цього гена \ (_i \) дорівнює

де \ (j \) проходить через весь набір еталонних генів.

Всі зразки обробляли однаково, отримуючи таблицю, що містить відносну кількість усіх генів усіх зразків. Профіль KO був отриманий шляхом підсумовування відносного ряду генів, які відповідали одному і тому ж KO. Оскільки один і той самий ген міг належати до більш ніж однієї групи KO, ми включили відносну кількість цих генів у всі KO.

Аналіз біорізноманіття

Індекс Шеннона та індекс подібності Серенсена-Дайса були розраховані на основі таблиці відносної чисельності 54 зразків.

Статистичний аналіз

Весь статистичний аналіз здійснювався за допомогою програмного забезпечення R. Аналіз основних координат (PCoA) був реалізований за допомогою пакету “ade4” [46]. Для вирівнювання відносної важливості загальних та рідкісних генів/видів/КО, було проведено перетворення квадратних коренів до PCA. Для порівняльного аналізу був використаний тест Уілкоксона з підсумками. Для порівняння різниць між експериментальними групами використовували парний тест Уїлкоксона з підсумками рангу, в якому метод Гоммеля використовувався для протидії проблемі багаторазового порівняння [47].

Визначення розміру ефекту, що використовується у функціональному аналізі, продемонстровано в рівнянні. (2), де \ (> _i \) - середня кількість функцій експериментальної групи \ (i \). Коефіцієнт кореляції Пірсона використовували для вимірювання кореляції між двома ознаками. Рівень значущості був встановлений на 0,05.