Enterococcus faecalis FK-23 впливає на альвеолярно-капілярну проникність для послаблення припливу лейкоцитів у легенях після зараження вірусом грипу

Анотація

Передумови

Грип - це дуже заразне гостре респіраторне захворювання, спричинене вірусами грипу, які належать до Orthomyxoviridae сім'я. Згідно з повідомленнями, опублікованими Всесвітньою організацією охорони здоров’я, приблизно 5–15% населення світу щорічно інфікується вірусом грипу А, і 250 000–500 000 цих інфікованих пацієнтів помирають щороку. Щорічна імунізація є основним засобом захисту від зараження вірусом грипу, але ця стратегія вакцинації може бути обмежена часом виробництва (Boltz et al. 2010). На додаток до стратегії вакцинації, противірусна терапія корисна для контролю за розповсюдженням грипу. Для профілактики та лікування грипу схвалено два класи противірусних препаратів (інгібітори М2-іонних каналів та інгібітори нейрамінідази) (Boltz et al. 2010; van der Vries et al. 2011). Однак ефективність цих противірусних засобів може бути обмежена швидкою появою резистентних до наркотиків вірусів (van der Vries et al. 2011).

Важка інфекція вірусу грипу може призвести до дифузного пошкодження альвеол, яке характеризується набряком легенів та накопиченням запальних клітин в легенях, з гістопатологічними особливостями гострого ураження легенів (ALI) та гострого респіраторного дистрес-синдрому (ARDS), найважчої форми АЛІ. Ці пошкодження легенів безпосередньо корелюють із пов'язаною з грипом захворюваністю та смертністю через порушення газообміну та дихальних функцій. ARDS характеризується збільшенням проникності альвеолярно-капілярного бар'єру, який утворюється мікросудинним ендотелієм і альвеолярним епітелієм, що призводить до припливу рідини та лейкоцитів в альвеолярний повітряний простір як через ендотелій, так і через епітелій (Nunes 2005 ). ALI та ARDS були основними причинами смерті після зараження пандемічними вірусами грипу H1N1 2009 року та високопатогенними вірусами грипу птиці H5N1 (Perrone et al. 2008; Zhang et al. 2012b).

Кілька експериментальних досліджень показали, що індукована грипом смерть пригнічується протизапальними агентами, які протидіють запальній реакції господарів, не впливаючи на саму реплікацію вірусу (Darwish et al. 2011; Garcia et al. 2010). Ці звіти вказують на те, що придушення підвищеної запальної реакції на вірусну інфекцію важливо для того, щоб уникнути смерті, спричиненої грипом.

Пероральне або інтраназальне введення молочнокислих бактерій ефективно проти інфекції вірусу грипу А (Izumo et al. 2010; Maeda et al. 2009). Ці введення бактерій допомагають посилити імунну відповідь господаря, що спричиняє зниження ефективності реплікації вірусу та/або підвищення регуляції експресії цитокінів. Раніше ми повідомляли, що водорозчинна фракція молочнокислої бактерії, обробленої лізоцимом Enterococcus faecalis FK-23 (LFK) знижує смертність, пов'язану з інфекціями вірусу грипу А (Kondoh et al. 2012). Однак механізм, що лежить в основі протигрипозного ефекту ЛФК, залишається незрозумілим. Раніше ми повідомляли, що пероральне введення LFK послаблює приплив еозинофілів у верхні дихальні шляхи на мишачій алергічній моделі (Zhu et al. 2012) та приплив запальних клітин у бронхоальвеолярну промивну рідину (BALF) на мишачій астматичній моделі (Zhang et al. . 2012а). Ці результати передбачають можливість протизапальної дії LFK під час зараження вірусом грипу. У цьому дослідженні ми демонструємо, що введення ЛФК знижує смертність після вірусної інфекції H1N1 та пригнічує надмірний приплив лейкоцитів, які викликають запальні реакції, до легенів за допомогою модуляції альвеолярно-капілярної проникності.

Результати

Зниження смертності заражених вірусом грипу мишей шляхом введення LFK

Для перевірки профілактичного ефекту проти грипу ми перорально вводили LFK мишам у дозі 15 мг на мишу один раз на день протягом 6 днів до і 17 днів після вірусної інфекції та контролювали рівень виживання протягом 17 днів після зараження ( Малюнок 1А). У цьому експерименті доза LFK була встановлена на рівні 15 мг на мишу, як попередній звіт, в якому мишам вводили водорозчинні фракції суспензії LFK (15 мг на мишу) (Kondoh et al. 2012). Однак у цьому експерименті застосовували суспензію LFK замість водорозчинної фракції LFK для всебічного розуміння механізму профілактики грипу LFK. Як показано на малюнку 1В, 16% мишей контрольної групи, яким вводили фізрозчин перорально, виживали протягом 17 днів після зараження. На відміну від цього, 45% мишей, яким вводили ЛФК перорально, вижили після зараження. Цей результат вказує на те, що пероральне введення ЛФК забезпечує ефективний захист від летальної інфекції вірусом грипу А.

Далі ми дослідили, чи покращення виживання зумовлене зниженням ефективності реплікації вірусу в легенях, оскільки пероральне або інтраназальне введення молочнокислих бактерій пригнічує ефективність реплікації вірусу в легенях (Maeda et al. 2009; Izumo et 2010). На відміну від цих звітів, вірусний титр у легенях не продемонстрував суттєвої різниці між групами, що вводили фізіологічний розчин та LFK, через 3 дні, 5 днів та 7 днів після зараження (DPI) (рис. 1С). Цей результат свідчить про те, що механізм, за допомогою якого пероральне введення ЛФК захищає від індукованої вірусом смерті, відрізняється від механізму, який повідомляється для інших молочнокислих бактерій.

Придушення інфільтрації лейкоцитів у легені після вірусної інфекції шляхом лікування LFK

Лейкоцити, включаючи запальні клітини, мононуклеарні клітини та лімфоцити, інфільтруються в область легенів після вірусної інфекції (Kohlmeier and Woodland 2009; Fukushi et al. 2011). Щоб отримати уявлення про захисний механізм, що лежить в основі активності LFK, ми забарвили відділи легенів за допомогою гематоксилін-еозину (ВІН). Це фарбування показало, що інфільтрація лейкоцитів у легеневу паренхіму була придушена при DPI-7 у групі, якій вводили ЛФК, тоді як інфільтрація лейкоцитів у легеневій паренхімі та альвеолярний колапс спостерігались у групі, що вводила фізіологічний розчин (рис. 2А та додатковий файл 1: Рисунок S1). Щоб підтвердити, що LFK пригнічує інфільтрацію лейкоцитів, ми гомогенізували видалені легені та підрахували кількість цілих легеневих клітин за допомогою мікроскопа. У групі, якій вводили фізіологічний розчин, кількість легеневих клітин зростало після вірусної інфекції і досягало максимуму при DPI-7 (рис. 2B). На відміну від контрольної групи, кількість цих клітин у групі, якій вводили LFK, суттєво пригнічувалась при DPI-5, DPI-7 та DPI-10 (рисунок 2B). Подібні результати були отримані для клітин BALF. Загальна кількість клітин в BALF була придушена в групі, якій вводили LFK при DPI-5, порівняно з кількістю в групі, що вводила фізіологічний розчин (рис. 2D).

Підвищення регуляції числа пневмоцитів типу II шляхом введення LFK

Дивно, але кількість цілих легеневих клітин при DPI-0 була значно вищою у мишей, яким вводили LFK протягом 6 днів до вірусної інфекції, ніж у групі, введеній фізіологічним розчином (Фігура 2B). Альвеолярні перегородки складаються з 2 типів пневмоцитів (тип I і II), сполучної тканини та кровоносних судин (Rogers 2010). Ми провели імуногістохімічний аналіз, оскільки на підставі спостережень за пофарбованими НЕ ділянками легенів при DPI-0 (додатковий файл 2: Рисунок S2A) ми очікували збільшення кількості пневмоцитів II типу. Фарбування маркером пневмоцитів типу II (proSP-C, білок просурфактант-C) показало, що кількість пневмоцитів типу II було підвищеним у групі, якій вводили LFK, порівняно з групою, що вводила фізіологічний розчин (Додатковий файл 2: Рисунки S2B і S2C ).

Придушення клітинної інфільтрації незалежно від типу клітини

Далі ми оцінили, які типи клітин інфільтруються в область легенів після вірусної інфекції. Популяції клітин кожного лейкоциту в легені аналізували при DPI-0, DPI-3, DPI-5, DPI-7 та DPI-10 за допомогою проточного цитометра. На ранній фазі зараження вірусом грипу вроджені імунні клітини, такі як моноцити, макрофаги та нейтрофіли, були завербовані в легені при DPI-5 та DPI-7 (рис. 2C). Після цього спостерігали міграцію Т-клітин (малюнок 2С). Однак не було суттєвої різниці між групами, введеними фізіологічним розчином та LFK, у популяції інфільтруючих клітин. Подібний результат був отриманий для популяції клітин в BALF при DPI-5. Групи, яким вводили фізіологічний розчин та LFK, не показали значної різниці в популяції лейкоцитів, які проникли в альвеолярний простір (рис. 2Е). Ці результати вказують на те, що придушення клітинної інфільтрації в легені відбувалося у всіх типах лейкоцитів, які ми аналізували.

Експресія генів хемокінів та цитокінів після вірусної інфекції

Хемокіни регулюють торгівлю різними типами лейкоцитів, а цитокіни можуть стимулювати вироблення хемокінів (Kohlmeier and Woodland 2009). Тому ми далі оцінювали рівень експресії мРНК цитокінів та хемокінів у легенях під час перебігу вірусної інфекції. Рівень експресії різних цитокінів Th1, прозапальних цитокінів, лігандів CCL-хемокінів та лігандів CXCL-хемокінів був підвищений після вірусної інфекції (малюнки 3A, 3B та додатковий файл 3: малюнки S3A та S3B). Однак суттєвої різниці в рівні експресії цитокінів та хемокінів не спостерігалося, за винятком CXCL4 (фактор тромбоцитів 4), який сам по собі не виявляє ніякої хемотаксичної активності до лейкоцитів (Kasper and Petersen 2011).

Придушення індукованої вірусом альвеолярно-капілярної проникності шляхом лікування LFK

Далі ми дослідили, чи придушення міграції лейкоцитів обумовлене змінами легенево-альвеолярно-капілярної проникності, оскільки запалення легенів під час вірусної інфекції тісно корелює з порушенням цілісності легеневого бар’єру (Steinberg et al. 2011; Fukushi et al. 2011 ). Зміна альвеолярно-капілярної проникності оцінювали шляхом моніторингу екстравазації синього барвника Еванса в BALF. Як показано на малюнку 4А, збільшення індукованого вірусом накопичення синього кольору Еванса було придушене при DPI-7 у мишей, яким вводили LFK. Це вказує на те, що введення LFK пригнічує індуковану вірусною інфекцією легеневу проникність, і що придушення запального клітинного припливу LFK відбувається за рахунок стабілізації цілісності альвеолярно-капілярного бар'єру.

Модуляція експресії генів, що контролює судинну проникність шляхом введення LFK

Повідомлялося про механізми контролю проникності судин під час запалення. Матричні металопротеїнази (ММР) є важливими регуляторними ферментами в прозапальних шляхах, і їх експресія та активність, як правило, підвищуються під час запального процесу. MMP розкладають основні компоненти судинної базальної мембрани та позаклітинного матриксу, такі як желатин та колаген, в альвеолярно-капілярному бар’єрі (Manicone and McGuire 2008). Тому ми досліджували рівень експресії мРНК ММР в легенях під час перебігу вірусної інфекції. Експресія MMP-7 після вірусної інфекції була придушена у групі, якій вводили LFK при DPI-7 (рис. 4B). Для інших ММП спостерігалась тенденція до зменшення у групі, яка отримувала ЛФК при DPI-7 (рис. 4В). Ці результати свідчать про те, що зниження регуляції експресії MMP шляхом введення LFK може послабити судинну проникність, спричинену вірусною інфекцією.

Дискусії

Компоненти LFK для здійснення протигрипозного ефекту залишаються невстановленими. Оскільки недавнє дослідження продемонструвало, що розчинний пептидоглікан коменсальних бактерій переноситься з кишечника в системний кровообіг (Clarke et al. 2010), одна з можливостей полягає в тому, що деградовані лізоцимом компоненти пептидоглікану можуть транслокуватися в легені, модулюючи тим самим альвеолярний -капілярний бар’єр. Ідентифікація активних компонентів у LFK буде важливою для подальшого розуміння точного механізму протигрипу.

У цьому дослідженні ми продемонстрували, що введення ЛФК покращувало показники виживання та придушувало проникнення лейкоцитів у легені після вірусної інфекції. Кілька факторів можуть сприяти впливу LFK проти інфекції вірусу грипу. Сюди входять придушення лейкоцитарної інфільтрації в легенях як зниженням регуляції експресії CXCL4, так і модуляцією проникності ендотелію та епітелію легенів за рахунок збільшення пневмоцитів II типу та пригнічення експресії MMPs. Наші висновки підтверджують думку, що придушення розпаду альвеолярно-капілярного бар’єру та подальший приплив лейкоцитів у легені покращить рівень виживання після вірусної інфекції. Стабілізація цілісності легеневого альвеолярно-капілярного бар’єру з використанням бактеріальних компонентів може бути корисною стратегією управління сезонним та пандемічним грипом.

Методи

Підготовка ЛФК

E. faecalis штам FK-23 культивували в бульйонному середовищі, що містить 2,5% глюкози, 1,4% дріжджового екстракту, 0,8% пептону та 4,4% K2HPO4, протягом 18 годин при 37 ° C, і культури збирали центрифугуванням. Після промивання дистильованою водою бактерії обробляли лізоцимом, а потім реакційну суміш нагрівали до 110 ° С протягом 10 хв перед ліофілізацією, як було описано раніше (Kondoh et al. 2012). LFK (15 мг/голову, розчинений у 200 мкл фізіологічного розчину) або фізіологічний розчин (200 мкл) вводили перорально за допомогою голки для годування один раз на день.

Підготовка вірусу

У цьому дослідженні використовували штам вірусу грипу A/Puerto Rico/8/34 (H1N1; PR8). Інфекційні матеріали обробляли в установі з біобезпеки 2 за схваленими протоколами згідно з керівництвом Університету Хоккайдо. Вірус готували, як описано раніше (Kondoh et al. 2012). Коротше кажучи, вірус розмножувався в аллантоїсних порожнинах 10-денних ембріонованих курячих яєць при температурі 35 ° C протягом 48 годин, а потім концентрувався та очищався центрифугуванням з градієнтом щільності. Очищений вірус суспендували у забуференному фосфатом сольовому розчині (PBS) і зберігали при -80 ° C до використання.

Миші та вірусна інфекція

Самці мишей C57BL/6N (віком 6 тижнів) були придбані у CLEA Japan. Мишей розміщували в клітинах-ізоляторах у кімнаті рівня 2 з біобезпеки (12 год цикл світло/темрява) із вільним доступом до стандартної дієти (CE-2; CLEA Японія) та водопровідної води. Ми проводили догляд за тваринами та експерименти відповідно до керівних принципів та схвалення Комітету з догляду та використання тварин Університету Хоккайдо (08–0231). Всі оперативні втручання проводились під ізофлурановою анестезією. Мишей злегка знеболювали ізофлураном (Dainippon Pharmaceutical, Осака, Японія) і інонулювали інтраназально 10 3 PFU по 50 мкл в обидві ніздрі в день 0. Виживаність та масу тіла контролювали щодня до 17 днів після вірусної інфекції. Щоб мінімізувати страждання після вірусного зараження, мишей ретельно спостерігали щодня, а мишей, які досягли затверджених критеріїв кінцевої точки, евтаназували передозуванням ізофлурану. Мишей евтаназували передозуванням ізофлурану на 17 день після зараження.

Титрування вірусу

Аналіз утворення нальоту проводили, як було описано раніше (Fukushi et al. 2011), з деякими модифікаціями протоколу. Мишей жертвували інгаляцією ізофлурану, а легені видаляли від мишей. Легені повністю гомогенізували в середовищі 1X MEM із застосуванням Micro smash (Tomy Seiko, Токіо, Японія), а гомогенати послідовно розбавляли холодним PBS. Для аналізу нальоту бляшки клітини собачої нирки Мадін-Дарбі (MDCK) висівали в платівку з 12 лунками з плоским дном за 24 год до зараження. Супернатанти гомогенатів легенів, серійно розведених, використовували для зараження злитих клітин MDCK при 37 ° C протягом 1 години. Клітини промивали і згодом покривали MEM, змішаним з 0,8% Bacto-агаром (Difco, Sparks, США) у присутності трипсину (5 мкг/мл). Платівки інкубували при 35 ° С протягом 2 днів і підраховували бляшки.

Гістологічний аналіз

Мишей жертвували інгаляцією ізофлурану, а легені видаляли від мишей. Видалені легені негайно фіксували у 10% буферизованому PBS формаліні. Вкладені в парафін тканини розрізали на товщину 4 мкм і фарбували гематоксиліном та еозином (Merck, США) із застосуванням стандартних гістологічних методів. Для імуногістохімічного дослідження зрізи тканини, вбудовані в парафін, інкубували з антипросурфактантним антитілом С, яке є маркером пневмоцитів типу II (Millipore, Billerica, США), інкубували з полімерною анти-кролячою системою, міченою пероксидазою хрону (DAKO, Glostrup, Данія), розроблений за допомогою системи envision +, що має маркування поліпропіленового кролика (DAKO Glostrup, Данія) та маркований гематоксиліном (Merck, США) відповідно до інструкцій виробника. Частка позитивних клітин білка С просурфактанта розраховували шляхом підрахунку кількості забарвлених гематоксиліном клітин та його позитивних клітин у 6 випадкових мікроскопічних полях при збільшенні 40.

Проточний цитометричний аналіз клітин легенів та BALF

ПЛР у реальному часі

ПЛР-реакцію в реальному часі проводили, як описано раніше (Kondoh et al. 2012). Коротше кажучи, загальну РНК екстрагували із цілих гомогенатів легенів за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, США) та Micro smash (Tomy Seiko, Токіо, Японія), а потім обробляли ДНКазою I (Takara bio, Otsu, Японія). КДНК синтезували з використанням праймерів oligo dT20 (Тойобо, Осака, Японія), випадкових праймерів (Тойобо, Осака, Японія) та ReverTra Ace (Тойобо, Осака, Японія). Кожна процедура виконувалась відповідно до інструкцій виробника. ПЛР у реальному часі проводили за допомогою SYBR Premix Ex Taq II (Takara bio, Otsu, Japan) із системою ПЛР MX3000P у реальному часі (Stratagene, La Jolla, USA). Умови циклічності використовувались як: 95 ° C протягом 10 секунд для активації ДНК-полімерази, потім 40 циклів при 95 ° C протягом 5 секунд та 60 ° C протягом 30 секунд. Рівні експресії кожної мРНК представляли як відносні експресійні кількості, які нормалізували за допомогою гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH).

Вимірювання альвеолярно-капілярної проникності

Альвеолярно-капілярний витік після вірусної інфекції визначали з використанням синього барвника Еванса, як описано раніше (Rhein et al. 2008). За дві години до вбивства мишам вводили внутрішньовенно через ретро-орбітальний синус під анестезією ізофлураном 0,2 мл 5 мг/мл синього кольору Еванса у PBS. BALF і сироватку збирали після вбивства мишей із ізофлураном і оптичну щільність визначали при 600 нм. Зміни проникності оцінювали за співвідношенням BALF/сироватки.

Статистичний аналіз

Дані виражаються як середнє значення ± стандартні відхилення (SD). Студентський т тест використовували для статистичного аналізу. Для аналізу смертності використовували метод Каплана-Мейєра з тестом log-rank. Значення P