Аномальні магнітні орієнтації магнітосомних ланцюгів у магнітотаксичній бактерії: Magnetovibrio blakemorei Штам МВ-1

Афілійований відділ хімії та хімічної біології Університету Макмастера, Гамільтон, Онтаріо, Канада

Партнерська школа наук про життя, Університет Невади в Лас-Вегасі, Лас-Вегас, Невада, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ хімії та хімічної біології Університету Макмастера, Гамільтон, Онтаріо, Канада

Саманбір С. Калірай,
Денніс А. Базилінський,
Адам П. Хічкок

Цифри

Анотація

Цитування: Калірай С.С., Базилінський Д.А., Хічкок А.П. (2013) Аномальні магнітні орієнтації магнітосомних ланцюгів у магнітотаксичній бактерії: штам Magnetovibrio blakemorei MV-1. PLoS ONE 8 (1): e53368. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053368

Редактор: Джош Нойфельд, Університет Ватерлоо, Канада

Отримано: 1 вересня 2012 р .; Прийнято: 30 листопада 2012 р .; Опубліковано: 8 січня 2013 р

Фінансування: CLS підтримується Канадським фондом інновацій (CFI), NSERC, Канадськими інститутами досліджень охорони здоров’я (CIHR), Національною науковою радою (NRC) та Університетом Саскачевана. DAB підтримується грантом Національного наукового фонду США (NSF) EAR-0920718. ALS підтримується директором Управління енергетичних досліджень Управління базових енергетичних наук Відділу матеріалознавства Департаменту енергетики США за контрактом № DE-AC02-05CH11231. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Магнетотаксичні бактерії (MTB) є повсюдними в морському та прісноводному середовищі [1], [2], [3]. Вони являють собою різноманітну групу філогенетично та морфологічно, пов’язану здатністю біомінералізувати мембранно-обмежені магнітні наночастинки, які називаються магнітосомами. Магнітосоми - це однодоменні магнітні кристали або магнетиту, Fe3O4, або грейгіту, Fe3S4 [4], зазвичай орієнтовані в одному або декількох ланцюгах. Магнітосоми відповідають за поведінку, яка називається магнітотаксисом, при якій клітини пасивно вирівнюються і плавають уздовж ліній геомагнітного поля Землі, які є похилими, крім екватора [5]. Зменшуючи тривимірну проблему пошуку до одного єдиного виміру, магнітотаксис дозволяє рухомим бактеріям ефективніше знаходити та підтримувати положення в оптимальному хімічному середовищі, як правило, оксично-аноксичній поверхні, у водних середовищах існування, що характеризуються вертикальними хімічними речовинами (наприклад, кисню) градієнти концентрації [5]. Таким чином, у хімічно стратифікованих середовищах існування МТБ, мабуть, має значну перевагу над немагнітотаксичними бактеріями у визначенні місця, де вони бажають [6].

МТБ, що виробляє магнетит, синтезує магнетизовані ланцюги, як правило, близько розташованих, когерентно вирівняних магнітосом, щоб максимізувати дипольну взаємодію з магнітним полем Землі [7], [8], [9]. Здатність відтворювати магнітосомні кристали магнетиту з високою хімічною чистотою, щільним розподілом за розмірами та рівномірною формою представляє вишуканий процес біомінералізації [10], [11]. Розподіл за розмірами кристалів магнітосом надзвичайно контролюється, щоб знаходитись в режимі однодоменного розміру [11], тим самим максимізуючи індивідуальний дипольний момент кожної магнітосоми та запобігаючи несприятливим ефектам, що залежать від розміру, таким як суперпарамагнетизм та утворення множинних доменів, які усувають або зменшують ефективність магнітної частинки.

Існує великий інтерес до розуміння біомінералізації та пов’язаних із нею процесів як із фундаментальної точки зору, так і для біоміметичних застосувань [12], [13]. Таким чином, невдовзі після первинного відкриття [14], [15] магнітотаксичних бактерій розпочались величезні зусилля, щоб глибоко зрозуміти явище, і воно триває і сьогодні. Велика частина зусиль, щоб зрозуміти біомінералізацію магнітосом, залучала генетичні методи, що не лише призвело до відкриття генів, що беруть участь у структурі, утворенні та організації магнітосом (гени mam, mms та mtx), але також виявило, що більшість з цих генів розташовані як скупчення в геномі, які в подальшому організовані як магнітосомний острів гена [16]. Такі методи, як просвічувальна електронна мікроскопія (ТЕМ), використовувались для заповнення прогалини в знаннях, яка пов’язана з розумінням ролі окремих генів мами, а також загальним розумінням росту ланцюга та взаємодії між окремими магнітосомами в ланцюзі [17].

Тут ми повідомляємо про дослідження, яке використовує скануючу передавальну рентгенівську мікроскопію (STXM) [23] - [25] та рентгенівський магнітний круговий дихроїзм (XMCD) [26] для визначення магнітних та хімічних властивостей ланцюгів магнітосом в окремих клітинах магнітотаксична бактерія Magnetovibrio blakemorei штам МВ-1 [27] на індивідуальному рівні магнітосоми [28], [29]. У той час як більшість попередніх досліджень були зосереджені на ланцюгах із регулярно розташованими магнітосомами, в яких магнітний вектор кожної магнітосоми вирівняний у тому ж напрямку, що і всі інші магнітосоми в ланцюзі, ми зосередили увагу на клітинах, які містять підланцюги, розділені просторовими прогалини. MV-1 був обраний в якості модельного організму через попередні спостереження просторових розривів між підланцюгами магнітосом у цих клітинах [7], [30]. Наші результати STXM-XMCD показують, що, на відміну від більшості магнітосомних ланцюгів, що вивчались на сьогоднішній день, підланцюги, розділені щілинами в МВ-1, можуть мати протилежну магнітну орієнтацію. Просторові зазори визначаються як зазори, що перевищують 50 нм, що набагато більше, ніж типові відстані поділу магнітосом у конденсованих ланцюгах. Наше вивчення цих випадків дає додаткове розуміння механізмів формування ланцюгів.

Експериментальний

Вимірювання STXM-XMCD

Крім того, можна отримати магнітно чутливі карти XMCD, що представляють собою різницю зображень, записаних з кожною поляризацією при одній, магнітно чутливій енергії фотона. Енергія фотона 708,2 еВ, енергія першого мінімуму в спектрі XMCD, забезпечує максимальну магнітну чутливість у випадку магнетиту.

Приготування магнітотаксичних бактерій

Клітини штаму Magnetovibrio blakemorei MV-1, досліджуваної магнітотаксичної бактерії, вирощували анаеробно в рідких культурах із закисом азоту як кінцевим акцептором електронів, як описано раніше [34]. Клітини збирали з культур на фазі росту від середини до пізньої експоненції.

Трансмісійна електронна мікроскопія

Клітини осідали на сітках із електронним мікроскопом із покриттям із звареного мідним покриттям, промивали для видалення солей культури та переглядали за допомогою просвічуючого електронного мікроскопа JEOL Model JEM 1200.

Результати

Зображення було записано при 709,8 еВ і перетворено в оптичну щільність (OD) з використанням інтенсивності в зонах без осередків на цьому зображенні. Стрілки вказують на клітини з очевидними прогалинами в їх магнітосомних ланцюгах. Знак питання (червоний) позначає (множинні) клітини, які були знижені через невизначеність щодо кількості клітин та/або ланцюгів магнітосом.

З 150 клітинних підмножин з цих 351 клітин, для яких вимірювали XMCD, було 6 клітин, що містять дві або більше підцепочок магнітосом з протилежними магнітними полярностями, що призводить до частоти магнітних аномалій 4,0 ± 0,2% від загальної кількості клітин популяції, і частота 9,9 ± 0,4% по відношенню до клітин із розривами ланцюгів магнітосом. Магнітні аномалії визначаються як магнітосомні ланцюги з принаймні одним зазором розміру магнітосоми в ланцюзі (> 50 нм), із зазором, що розділяє підланцюги з протилежною магнітною орієнтацією.

Малюнок 2а показана одна клітина MV-1, що містить характерний перерваний ланцюг магнітосом. На рис. 2b та 2c представлені спектри поглинання рентгенівських променів Fe 2p3/2 для двох ділянок ланцюга та пов'язані з ними сигнали XMCD відповідно. Спектральні сигнали показують, що існує інверсія магнітного сигналу одного відносно іншого. На рис. 2г представлений кольоровий композит сигналів XMCD з таким для клітинного матеріалу, як візуалізується при 704 еВ, нижче початку Fe 2p-краю. Ця презентація наочно показує, що магнітна орієнтація ділянки ланцюга зліва протилежна орієнтації ділянки ланцюга праворуч. Суперпозиція двох клітин з окремими ланцюжками виключається через середнє зображення до краю (синє на рис. 2г), яке чутливе до щільності клітин. Якби на цьому зображенні було накладено дві комірки, сигнал перед краєм на перетині був би помітно більшим, ніж на кінцях ланцюга, де зображення чітко відповідає зображенню окремої комірки.

(а) зображення STXM (OD). Дві підланцюги позначені ланцюгом 1 і ланцюгом 2. Кожна магнітосома позначена як a-g. (b) Спектри Fe 2p3/2 лівого ланцюга (верхнього) та правого ланцюга (нижнього), записані за допомогою двох кругових поляризацій. (c) сигнали XMCD, отримані відніманням двох спектрів кругової поляризації. (d) Кольоровий композит клітини (OD зображення при 704 еВ) (синій), магнітосоми з поляризацією вліво (зелений) і поляризацією вправо (червоний). Стрілки на рис. (А) і (d) означають "премагнітосому" - див. Текст.

Спектр Fe 2p3/2 зазору між двома магнітосомними підланцюгами (червоний); кристал незрілого, можливо суперпарамагнітного, магнітосомного кристала (зелений); у клітинній цитоплазмі (синій) та в одній магнітосомі (оранжевий) порівняно в Малюнок 3. Це порівняння показує, що в щілині більше заліза, ніж в частинах клітини поза ланцюгом магнітосоми. Крім того, спектральна форма заліза в зазорі відрізняється від форми зрілих та незрілих кристалів магнітосоми магнетиту. Сигнали при ~ 708 еВ та ~ 710 еВ традиційно пов'язані зі ступенем окиснення Fe (II) та Fe (III) відповідно (хоча спектри чистого виду Fe (II) та чистого Fe (III) містять певний сигнал для кожної енергії). Площа щілини має вищий вміст Fe (II), ніж у зрілому кристалі магнітосоми. Спектр Fe 2p3/2 зрілих кристалів магнітосоми добре збігається зі спектром еталонного магнетиту [29]. Спектр Fe 2p3/2 незрілого кристала магнітосоми подібний до спектру зрілого, але він немагнітний (нульовий XMCD).

(b) спектри Fe 2p3/2 (середнє значення лівої та правої кругової поляризації даних) різних областей клітини: одиночна магнітосома (червона), перша щілина (рожева), „домагнітосома“ (зелена) та цитоплазма клітини (синя) від магнітосомного ланцюга. (c) Розширення зазору та премагнітосомні спектри. Вертикальні лінії позначають енергії, традиційно пов'язані з сигналами стану окиснення Fe (II) та Fe (III).

Малюнок 4a показує TEM-зображення цілої цілої клітини MV-1, тоді як Малюнок 4b - відповідне зображення STXM тієї ж комірки при 709,8 еВ. У цій клітині є три підланцюги магнітосом, між якими є проміжки. Карта XMCD трьох підланцюгів (Рисунок 4c) показує, що між ланцюгом 1 і ланцюгами 2 і 3 існує протилежна магнітна орієнтація. Це відображається у протилежному сенсі спектрів XMCD для трьох підланцюгів (Рисунок 4d ). У середньому сигнал XMCD ланцюга 1 більший, ніж сигнал ланцюгів 2 і 3.

(а) ТЕМ-зображення клітини. Прямокутні темні предмети - це кристали солі із середовища росту. Пунктирна біла лінія вказує на межу клітини, яка містить 3 підланцюги. (b) зображення STXM при 709,8 еВ ідентичної області. (c) Кольоровий композит сигналу XMCD від ланцюга магнітосоми. (d) XMCD-спектри 3-х під ланцюгів.

Обговорення

З рис. 3в видно, що розподіл видів заліза в щілині має більше вмісту заліза, Fe (II), ніж магнетит. Попередні дослідження показали, що форма заліза, яке транспортується до магнітосомних пухирців з утворенням біогенного магнетиту, має залізну природу [35], [36], [37]. Будь-який транспорт залізного заліза, швидше за все, включатиме сидерофори, щоб запобігти опаданню будь-якого Fe (III) [38]. Франкель та ін. [37] використовував 57 Fe Мессбауерську спектроскопію для вивчення природи та розподілу основних сполук заліза в M. magnetotacticum. Вони запропонували модель, при якій Fe (III) поглинається клітиною неспецифічними способами, відновлюючись до Fe (II), потрапляючи в клітину, потім повторно окислюючись до оксиду Fe (III) під час утворення магнітосом. Той факт, що спектральна сигнатура Fe 2p3/2, виявлена в зазорі, має більш залізний характер, ніж магнітосоми, узгоджується з цим уявленням. Цей сигнал заліза може надходити від магнітосомної везикули, яка або не встигла осадити магнетит, або знаходиться безпосередньо до утворення магнетиту.

Однією з можливостей, яка могла б пояснити спостереження, є те, що аномальні клітини відчували високе зовнішнє магнітне поле, яке змінило магнітну орієнтацію однієї половини часткового ланцюга, не впливаючи на другу половину. Це дуже неправдоподібно, оскільки для обернення моменту однодоменного кристала магнетиту потрібно велике магнітне поле в площині (~ 6,37 × 10 4 А/м) [9]. Якби на зразок потрапляли зовнішні поля такої величини, можна було б очікувати, що на обидва підланцюги впливатиме однаково. Друга можливість полягає в тому, що на магнітосомний ланцюг впливало поле протилежно орієнтованого ланцюга в клітині, яке потрапило в безпосередню близькість. Однак поле, генероване магнітосомним ланцюгом, зовнішнім від клітини, є занадто слабким, щоб змінювати намагніченість магнітосом всередині сусідньої клітини через велике поле внутрішньоклітинних ланцюгів і швидке падіння сили магнітного поля зі збільшенням відстані. Раніше було виявлено, що напруга примусового поля від 1,90 × 10 3 до 2,85 × 10 3 А/м є необхідною для перемикання полярності ланцюга МВ-1 із 15 магнітосом [7]. Однак це може змінюватися, оскільки примусові поля магнітосомних ланцюгів є функцією довжини ланцюга, міжчастотного інтервалу та розміру магнітосом [40].

Відстані розраховували на основі зображень, показаних на малюнках 2а та 4b. Відстані зазорів зліва направо на малюнку 2а становлять 107 ± 8 нм та 96 ± 8 нм (враховано ракурс через нахил зразка). Для малюнка 4b відстані зліва направо складають 150 ± 7 нм, 46 ± 13 нм і 242 ± 17 нм. Розрахунки, засновані на простій точковій моделі намагнічування, виконувались за допомогою ланцюгової установки, зображеної на малюнку 2а. Магнітний момент ланцюга з 15 магнітосом у клітині МВ-1 був розрахований на 7,1 × 10 −16 Am 2 за допомогою вимірювань електронної голографії [7]. Виходячи з цього результату, середній магнітосомний магнітний момент оцінюється в 4,5 × 10 −17 Am 2 для кожної з 4 магнітосом на рис. 2. Поле в “магнітосомі e” в ланцюзі 2 від сусіднього 4-магнітосомного ланцюга приблизно 5,5 × 10 4 А/м у напрямку експериментально визначеного моменту. Без присутності “магнітосоми f” поле в магнітосомі було б ∼4,4 × 10 3 А/м у зворотному напрямку моменту. За відсутності відповідно орієнтованої магнітосоми це поле повинно бути достатньо сильним, щоб переорієнтувати “магнітосому е” згідно з попередніми дослідженнями на магнітному гістерезисі магнітосом [7].

Комейлі та ін. [21] та Scheffel et al. [20] показали, що в клітинах видів Magnetospirillum магнітосоми локалізуються і збираються ниткоподібним актиноподібним білком MamK, який, здається, утворює прокаріотичний цитоскелет, відповідальний за стабільність ланцюга магнітосом. Кислий білок мембранної магнітосоми, мабуть, відповідальний за прикріплення магнітосоми до MamK [20]. Крім того, вважається, що магнітосоми частково агрегуються за допомогою магнітних взаємодій [20]. Клітини Magnetovibrio blakemorei містять ген гена mamK у своєму геномі, але не mamJ. Це може припустити, що механізм утворення ланцюга магнітосом дещо відрізняється від Magnetovibrio blakemorei від механізму у видів Magnetospirillum і може бути причиною наявності розривів між магнітосомами в MV-1.

Частота клітин з магнітосомними підланцюгами з протилежною магнітною орієнтацією низька. Наш статистичний аналіз вказує на 4,0% усіх клітин та 9,9% тих клітин, які містять розрив. Однак, оскільки експеримент XMCD дає магнітну інформацію лише для горизонтально орієнтованих ланцюгів (інтенсивність XMCD падає на косинус відхилення від горизонталі), наша частота, швидше за все, є заниженою. Ми підрахували, що сигнал XMCD можна спостерігати лише в тому випадку, якщо ланцюг горизонтальний в межах ± 20 ° через це ослаблення та статистичні межі наших вимірювань. Беручи до уваги цей фактор, передбачувана частота цього явища для МВ-1 зросте з 4,0 ± 0,2% до 18,0 ± 0,9%, якщо врахувати всю популяцію МВ-1, і з 9,9 ± 0,4% до 44,6 ± 1,8% для МВ -1 клітини з ланцюгами магнітосом, що містять прогалини. Нарешті, невідомо, чи мають клітини MV-1 у природі розриви між магнітосомами та/або магнітосомними ланцюгами і, отже, чи мають вони ланцюги з протилежною магнітною орієнтацією. Це важливо, оскільки в цей час ми не можемо виключити можливість того, що прогалини є артефактом внаслідок умов зростання та/або темпів зростання. Для дослідження цієї можливості потрібні додаткові експерименти з ростом, а також спостереження за необробленими дикими зразками.

Висновки

Ми показали, що деякі клітини Magnetovibrio blakemorei, які містять магнітосомні підланцюги, розділені просторовими проміжками, мають аномальну магнітну орієнтацію. Показано, що частота цього становить щонайменше 4,0% усіх клітин та 9,9% тих клітин, які мають пробіли. Фактична частота, ймовірно, значно вища, враховуючи характер наших вимірювань. Усі випадки обернення орієнтації, що спостерігаються, пов'язані з розривом, що дозволяє припустити, що аномальна орієнтація підланцюгів зумовлена недостатніми магнітостатичними взаємодіями між підланцюгами, розділеними зазорами.

Подяки

Ми дякуємо кільком анонімним рецензентам за надання дуже корисних коментарів та інформації, зокрема щодо сил намагнічування, що діють на розвиваються магнітотаксичні бактерії. Ми дякуємо докторам. Цзян Ван і Чітра Карунакаран за експертну підтримку в Канадському джерелі світла (CLS) та доктора Толека Тіліщака за експертну підтримку приладів STXM в Advanced Source Light (ALS) і CLS. Більшість досліджень XMCD проводились на STXM на променевій лінії 10ID1 в CLS. Приклад, показаний на рис. 4 було виміряно на STXM на променевій лінії 11.0.2 на ALS.

Внески автора

Задумав та спроектував експерименти: SSK APH DAB. Виконував експерименти: SSK APH. Проаналізовано дані: SSK. Внесені реагенти/матеріали/інструменти для аналізу: DAB APH. Написав папір: SSK DAB APH.