Аналіз бактеріального та грибкового складу зерен і молока кефіру на основі секвенування з кількох джерел

Філії Teagasc Food Research Center, Мурепарк, Фермой, Ірландія, Центр харчової фармабіотики, Університетський коледж Корка, Корк, Ірландія, Мікробіологічний департамент, Університетський коледж Корка, Корк, Ірландія

Філія Teagasc Food Research Center, Мурепарк, Фермой, Ірландія

Центр харчової фармабіотики, Університетський коледж Корка, Корк, Ірландія, Відділ мікробіології, Університетський коледж Корка, Корк, Ірландія

Філії Teagasc Food Research Center, Мурепарк, Фермой, Ірландія, Центр харчової фармабіотики, Університетський коледж Корка, Корк, Ірландія

Алан Дж. Марш,
Орла О’Салліван,
Колін Хілл,
Р. Пол Росс,
Пол Д. Коттер

Цифри

Анотація

Цитування: Marsh AJ, O’Sullivan O, Hill C, Ross RP, Cotter PD (2013) Аналіз бактеріального та грибкового складу зерна та молока кефіру на основі секвенування з кількох джерел. PLoS ONE 8 (7): e69371. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069371

Редактор: Колін Дейл, Університет штату Юта, Сполучені Штати Америки

Отримано: 24 березня 2013 р .; Прийнято: 7 червня 2013 р .; Опубліковано: 19 липня 2013 р

Фінансування: Центр харчової фармабіотики - це дослідницький центр, що фінансується Науковим фондом Ірландії (SFI) через Національний план розвитку уряду Ірландії. Автори та їхні роботи були підтримані грантом SFI CSET APC CSET 2 грантом 07/CE/B1368. Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Кефір - це напої на основі кисломолочного молока. Це в’язкий, самогазований, кислий напій, який містить низький відсоток алкоголю і, як вважають, виник у Кавказьких горах близько 2000 років тому. Молоко зброджується твердою, схожою на цвітну капусту, полісахаридною матрицею, відомою як зерно кефіру, яке повторно використовується для початку подальшого бродіння. Зерно в основному складається з кефірану, виробленого бактеріями [1], який містить у собі складний консорціум бактерій і дріжджів, які працюють в симбіозі для зброджування молока [2].

Незважаючи на безсумнівну цінність вищезазначених досліджень, аналіз на основі культури обмежується лише виявленням видів, здатних рости на конкретному використовуваному середовищі. Таким чином, незалежні від культури методики можуть забезпечити більш точний та поглиблений аналіз. Хоча незалежні від культури методи, такі як секвенування Сангера [12], [16], [20], [21] та DGGE [14], [15], [22], використовувались для вивчення популяції кефіру, застосування високих -послідовність послідовності ДНК для дослідження таких мікробних екосистем стала особливо значним розвитком. Ця стратегія була використана для вивчення мікробного складу ряду ферментованих харчових середовищ, таких як сир [23], [24], ферментована риба [25], [26], ферментовані овочі [27], рисові висівки [28] та каша з пшоняного перла [29]. Дійсно, високопродуктивне секвенування ДНК також нещодавно було використано для отримання більш повного розуміння бактеріальної популяції одного зерна і молока ірландського кефіру та трьох зерен кефіру Бразилії [30], [31].

Окрім визначення потенційно сприятливих для здоров’я популяцій, комерціалізація виробництва кефіру могла б отримати користь від детального розуміння пов’язаних мікробних популяцій. Існує також необхідність оцінити неоднорідність цих популяцій щодо великої кількості зерен і, зокрема, застосувати молекулярні підходи для кращої характеристики асоційованих популяцій дріжджів. У світлі цих вимог метою цього дослідження було використання високопродуктивних методів секвенування для глибокого аналізу мікробного консорціуму з 25 різних зерен кефіру та молока, отриманих з різних джерел, з метою мінімізації будь-яких географічних упереджень що може вплинути на флору. Це дослідження являє собою перший випадок, коли ця технологія була застосована до такої великої кількості зразків кефіру, і є першим дослідженням такого роду, щоб виявити грибковий компонент кефіру.

Матеріали та методи

Підтримка культури

9 Ірландських кефірних зерен було розроблено з -80 ° C у сховищі Teagasc Culture Collection шляхом ферментації у 10% відновленому знежиреному молоці (RSM), яке стерилізували при 115 ° C протягом 15 хвилин. Вони спочатку були придбані у домогосподарок по всій країні [18], а для цілей цього дослідження були позначені IR1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 і 10. Додаткові 16 зерен були отримані від індивідуальних та комерційних постачальники з ряду різних місць (таблиця S1) та культивуються в однакових умовах. Зразки з Великобританії були позначені UK1 до UK5, а зразки з США - US1, 2, 3 і 5. Інші зерна кефіру отримували з Іспанії (Sp1), Франції (Fr1), Італії (It1), Канади (Ca1 ) та Німеччини (Ger1 та Ger2). Культури витримували при кімнатній температурі та інокулювали у свіже молоко 3 рази на тиждень протягом мінімум 4 місяців до вилучення.

Метагеномна екстракція ДНК

100 мл 10% RSM інокулювали 1 г кефірного зерна і ферментували при 25 ° C протягом 24 годин, час, коли кефір готують найчастіше. Для вилучення ДНК з кефіру 1,8 мл збродженого молока центрифугували для отримання гранул, які суспендували в 450 мкл буфера для лізису Р1 з набору для ізоляції мікробної ДНК Powerfood (MoBio Laboratories Inc, США). Ресуспендовану гранулу піддавали ферментативному розщепленню ферментами мутанолізину (100 Од/мл) та лізоциму (50 мкг/мл) при 37 ° С протягом 1 години, після чого перетравлювали протеїназу К (250 мкг/мл) при 55 ° С протягом 1 год. Екстракцію оптимізували за допомогою 10-хвилинної інкубації 70 ° C [40] перед механічним лізисом за допомогою Qiagen TissueLyser II (Retsch®). Потім було використано набір мікробної ізоляції ДНК Powerfood відповідно до інструкцій виробника. Чиста ДНК елюювалась у стерильній воді для ВЕРХ. ДНК із кефірного зерна була виділена за допомогою модифікованої процедури екстракції на основі фенол-хлороформу [22].

Ампліфікація ДНК та піросеквенування

Аналіз даних піросеквенування

Результати

Бактеріальна популяція кефірного молока є більш послідовною та менш різноманітною, ніж популяція відповідних зерен

Фільтрація після якості, 106 235 та 136 815 зчитувань для 23 зерна та відповідних 23 зразків молока, відповідно, залишилася, дорівнюючи в середньому 4619 зчитувань для кожної проби зерна та 5949 зчитувань на пробу молока.

Були розраховані значення Chao1 (відображають OTU/багатство видів), індекси Шеннона та Сімпсона (для визначення видового різноманіття), а також цифри філогенетичного різноманіття та спостережуваних видів (таблиця S2). Криві розрідження, розраховані за подібністю 97%, наближаються паралельно осі х для всіх зразків, що вказує на те, що отримано достатньо показань для адекватної оцінки сукупності (рис. S1). Поточний аналіз показує, що популяція бактерій у кефірному молоці, як правило, менш різноманітна, ніж у зернах кефіру (рис. S2), де медіана значення (чорна смужка) для молока була нижчою за всіма показниками, за винятком Шеннона індекс. Єдина суттєва різниця між зерном та молоком була у філогенетичному різноманітті (p 2 = 0,924, p = 0,644, малюнок 2A). Подібність між кефірними зерновими громадами не була такою ж, як подібність між кефірними громадами.

Зелений = ірландський кефір, оранжевий = бельгійський кефір, світло-коричневий = іспанський кефір, червоний = німецький кефір, сірий = американський кефір, рожевий = італійський кефір і фіолетовий = британський кефір.

Два різні типи зразків пов’язані між собою смужкою (білий колір - флора зерна; червоний - флора молока). Напрямок кожної осі довільний.

Альфа-різноманітність грибних популяцій у кефірних молоках та зернах різниться, але бета-різноманітність зерен кефіру більша, ніж у молоків

Відфільтровано якість після публікації, загалом отримано 118 879 та 118 976 зчитувань, що відповідають 23 зерновим та відповідним 23 популяціям молока, відповідно. Це прирівнювалось до середнього показника зчитування 5167 та 5173 на зразок зерна та молока відповідно.

Значення альфа-різноманітності встановили, що природно низька різноманітність зерен і молока кефіру (таблиця S3). Аналіз індексів Chao1, спостережуваних видів та філогенетичного різноманіття на основі графіків свідчить про те, що різноманітність більша у кефірному молоці, ніж у зернах (рис. S3). Однак статистична різниця між ними була обмежена філогенетичним різноманіттям (p 2 = 0,855, p = 0,139, рисунок 2B).

У зернах кефіру та пов’язаних з ними кисломолочних кефірах переважає відносно невелика кількість бактеріальних поколінь

Послідовність ITS забезпечує детальний аналіз грибкового складу зерен кефіру та пов’язаних з ним кефірних молоків

Єдиним грибним типом, призначеним у зерні, була Ascomycota, найбільший вид грибного царства. Також було показано, що аскомікоти домінують у кефірному молоці, коливаючись від високих 100% у Ger1 до найнижчих 89,38% у Ir10 (таблиця S6; таблиця S7). Basidiomycota, інший тип, що належить до підцарства Dikarya, був виявлений у 9 зразках молока при відносно низьких показниках зчитування. У 9 зразках молока також містилися незначні кількості некультурних грибів. Менша різноманітність зерна знову виявляється на сімейному рівні, де всі зразки, крім однієї (Sp1), містять> 99% Saccharomycetaceae. Загальна середня частка Saccharomycetaceae значно нижча в молоках (р 99% показів у 16 з 23 зразків. Грибний склад кефірного молока Sp1 був незвичним завдяки вмісту 34,27% Pichiaceae. На відміну від цього, наступна за величиною частка Pichiaceae становить 0,48% (в молоці UK3). Інші грибкові сімейства виявлені в обох кефірних молочка і зерна були Davidiellaceae і Trichocomaceae. Herpotrichiellaceae, Teratosphaeriaceae, Valsaceae, Debaryomycetaceae, Phaffomycetaceae, Malasseziaceae, Bondarzewiaceae, Dermataceae, Pezizaceae, Ganodermataceae, Tricholomataceae, тремелломіцети. Крім того, валеміоміцети були виявлені лише в молоці, тоді як Dothioraceae - лише в зернах.

На відміну від зчитувань 16S, які підлягають високому рівню гомології послідовностей, зчитування ITS були досить несхожими, щоб дозволити віднесення до видового рівня. У таблиці 1 наведено загальну кількість різних ідентифікованих видів та чи існувала раніше асоціація з кефіром. Профіль популяції на видовому рівні сильно відображає такий на рівні роду. Найпоширеніший вид, Kazachstania unispora, був присутній у 20 зернах та у всіх молоках. Усі зчитування з родів Kluyveromyces та Naumovozyma були віднесені до видів Kluyveromyces marxianus та Naumovozyma castelli, відповідно (Таблиця S6; Таблиця S7). Незважаючи на те, що рід Saccharomyces був ідентифікований у невеликих кількостях у ряді зерен та молока, лише ті, що містять Ir5, були віднесені до видового рівня (до Saccharomyces cerevisiae).