Абляція GPR105 запобігає запаленню та покращує чутливість до інсуліну у мишей з ожирінням, спричиненим дієтою

Ця стаття має виправлення. Дивіться:

Анотація

Вступ

Інсулінорезистентність є основною метаболічною особливістю ожиріння та ключовим фактором патогенезу діабету 2 типу. Багато рядків доказів показують, що активація прозапальних шляхів у тканинах-мішенях інсуліну може погіршити передачу сигналів про інсулін, і хронічне запалення тканин низького рівня визнано важливою причиною системної інсулінорезистентності (1). Кілька досліджень показали, що макрофаги, ключовий компонент вродженого імунного захисту від патогенних мікроорганізмів, є критично важливими ефекторними клітинами в цьому прозапальному процесі.

Макрофаги, присутні в незапалених тканинах (резидентні макрофаги), допомагають підтримувати гомеостаз і беруть участь у ремоделюванні тканин (2). Однак при ожирінні стани макрофаги накопичуються в жировій клітці, печінці та м’язових тканинах, виділяючи прозапальні цитокіни, такі як TNF-α та IL-6, які індукують клітинну резистентність до інсуліну шляхом активації передачі сигналів JNK або IκB кінази β із сериновим фосфорилюванням рецептора інсуліну. субстратні білки. Доведено, що макрофаги, які нещодавно набрані після дієти з високим вмістом жиру (HFD), відрізняються від резидентних макрофагів у жировій тканині, проявляючи підвищені прозапальні властивості (3). Хоча як вроджена, так і адаптивна імунна система були причетні до активації та вербування макрофагів при ожирінні (4), точні механізми, що регулюють відбір нових макрофагів до тканин-цілей інсуліну, неясні.

G-білкові рецептори (GPCR) опосередковують різні фізіологічні функції, які ставлять ці білки як терапевтичні мішені при метаболічних захворюваннях. Вони також є мішенню приблизно половини всіх сучасних лікарських препаратів (5). GPR105 (також відомий як рецептор P2Y14) є членом підгрупи GPCR, що активно активується піримідиновими UDP-цукрами, особливо уридин-5-дифосфоглюкозою (UDP-Glc) (6). GPR105 широко експресується в декількох тканинах людини, включаючи плаценту, жирову тканину, шлунок, кишечник та окремі ділянки мозку (6). Примітно, що GPR105 також помітно експресується в імунних клітинах, включаючи макрофаги, лімфоцити та нейтрофіли (7–9). Попередні дослідження показали, що GPR105 регулює хемотаксис лейкоцитів у відповідь на UDP-Glc (10, 11).

Оскільки GPR105 бере участь у вродженій імунній відповіді, ми припустили, що GPR105 може сприяти ініціації інсулінорезистентності, спричиненої ожирінням. У цьому дослідженні ми оцінили вплив делеції GPR105 у цілому тілі та кістковому мозку (офіційна назва гена: P2ry14) на дію інсуліну та гомеостаз глюкози. Ми показуємо, що GPR105 в імунних клітинах опосередковує рекрутування макрофагів у печінку при хронічному годуванні HFD з подальшим місцевим запаленням та резистентністю до інсуліну. Таким чином, GPR105 може забезпечити новий зв’язок між вродженим імунітетом та резистентністю до інсуліну.

Матеріали та методи

Тварини

Метаболічні дослідження

Вимірювання тригліцеридів та глікогену

Вміст тригліцеридів (TG) вимірювали в гомогенатах печінки в PBS, що містить 5% Triton X-100, та у зразках плазми (EnzyChrom, BioAssay Systems, Hayward, CA). Рівні глікогену вимірювали методом Seifter et al. (15).

Гістологія

Фарбування H&E на зрізах печінки та жирової тканини проводило Каліфорнійський університет, штат гістології Сан-Дієго, в Центрі раку Мура. Для імуногістохімії використовували анти-Mac2 (Cedarlane Labs) та anti-F4/80 (Abcam, Cambridge, MA) Abs.

Імуноблот-аналіз

Для аналізу фосфо-Akt, стимульованого інсуліном, мишей голодували протягом 7 год, а потім вводили 0,2 од/кг інсуліну через нижню порожнисту вену під наркозом. Тканини брали до або після ін’єкції (3 хв для печінки та 10 хв для білої жирової тканини епідидимуму [eWAT] та скелетних м’язів), заморожували та піддавали аналізу Вестерн-блот, проведеному за стандартними методиками. Абс проти p-Akt (Ser 473), Akt та α-тубуліну отримували від Cell Signaling Technologies (Beverly, MA). Щоб виміряти фосфорилювання Akt, ми імуноблотували солюбілізовані екстракти, що містять рівні кількості тканинного білка, з кролячим поліклональним Abs проти Akt або фосфо-Ser 473 Akt (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), з наступним виявленням Ab. Для кількісного визначення відносну інтенсивність білкових смуг вимірювали за допомогою ImageJ і виражали як довільні одиниці.

Виділення РНК та кількісна RT-PCR

Загальну РНК виділяли з клітин та тканин за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія) відповідно до інструкцій виробника. КДНК першої нитки синтезували за допомогою комплекту зворотної транскрипції кДНК високої ємності (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія). Зразки проводили в реакціях 20 мкл із використанням 96-лункового термоциклера MJ Research PTC-200 у поєднанні з чотириколірною системою реального часу Chromo 4 (GMI, Ramsey, MN). Рівні експресії генів обчислювали після нормалізації до стандартного гена ведення домашнього господарства РНК-полімерази II (RPII), використовуючи метод ΔΔCT, як описано раніше (16). Послідовності праймерів доступні в Додатковій таблиці I.

Відстеження моноцитів

Кров, зібрану з ретро-орбітального синуса мишей WT або GPR105 KO, піддавали лізису еритроцитів, а підгрупи моноцитів збагачували набором збагачення моноцитів миші EasySep (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Британія, Канада). Ізольовані моноцити від 10–15 мишей кожного генотипу об’єднували разом. Потім ці моноцити (5 × 10 5 - 10 × 10 5) промивали у безсироватковому RPMI і суспендували у 2 мл розчину розчинника C. PKH26 (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі), розчинений при 2 × 10 −3 М в розчинник C, і клітини інкубували протягом 10 хв при кімнатній температурі в темряві. Реакцію фарбування зупиняли додаванням рівного обсягу середовища з додаванням 10% FBS. Суміш центрифугували, клітини промивали один раз і ресуспендували в середовищі, що містить сироватку. Після мічення PKH26 підраховували моноцити і ×1 × 10 5 життєздатних клітин суспендували в 0,2 мл PBS і вводили у стегнову вену мишей WT, які отримували HFD. Через п’ять днів після ін’єкції макрофаги жирової тканини (АТМ) та непаренхіматозні клітини печінки були виділені та проаналізовані за допомогою аналізу FACS.

Аналіз FACS макрофагів з жирової стромальної судинної фракції та печінки

Епідидимальні жирові прокладки зважували, промивали в PBS, а потім подрібнювали в буфері FACS (PBS/1% BSA). Адипоцити та стромальні судинні клітини готували з перетравленої колагеназою жирової тканини (17). Клітини макрофагів печінки отримували двоступеневим перетравленням і фракціонуванням колагенази печінки на градієнті щільності (18). Аналізи FACS судинних клітин строми на вміст і підтипи макрофагів проводили, як описано раніше (17). Абс, що використовувались для поверхневого фарбування, були F4/80 (BM8), CD11b (M1/70) та CD11c (N418; eBioscience, Сан-Дієго, Каліфорнія).

Культура макрофагів, отриманих з кісткового мозку, та аналіз хемотаксису in vitro

Посів макрофагів кісткового мозку (BMDM) проводили, як описано раніше (17). Коротше кажучи, клітини кісткового мозку відмивали від стегнових і гомілкових кісток мишей WT та GPR105 KO віком від 10 до 12 тижнів. Потім клітини диференціювали на BMDM у середовищі RPMI, що містить rM-CSF, FBS з низьким рівнем ендотоксину та стрептоміцин/пеніцилін. Через п’ять днів після диференціації клітини збирали і суспендували в DMEM з 1 г/л глюкози. Аналіз хемотаксису in vitro проводили, як описано раніше (19). Приблизно 10 5 клітин висівали у верхню камеру 8-мкМ полікарбонатного фільтра (24-трансульверний формат; Corning, Lowell, MA), а DMEM із зазначеними концентраціями UDP-Glc поміщали у нижню камеру. Через 3 год підраховували клітини, які мігрували в нижню камеру.

Вимірювання рівня UDP-глюкози в плазмі

Зразки плазми депротеїнізували 5% трихлороцтовою кислотою з подальшою екстракцією етилового ефіру та нейтралізацією. Кількісний вміст UDP-Glc в екстрактах визначали за допомогою аналізу, який базується на ферментативному перетворенні [32 P] -пірофосфату (32 PPi) + UDP-глюкози в [32 P] UTP + глюкоза-1 P, як описано раніше ( 20). Коротше кажучи, зразки інкубували протягом 1 години у присутності 1 U/мл пірофосфорилази UDP-Glc з хлібопекарських дріжджів (Sigma) та 100 нМ 0,1 мкКі 32 PPi (Perkin Elmer). Інкубації припиняли додаванням 0,5 мМ PPi та подальшим нагріванням (2 хв при 95 ° C). Отримані в результаті [32 P] види розділяли за допомогою ВЕРХ через колонку Nova-Pack C18 (Waters) та кількісно визначали в Інтернеті за допомогою аналізатора Flo-One 500TR Radiomatic (Packard). Калібрувальну криву використовували відомі кількості UDP-глюкози (Fluka) паралельно.

Статистичний аналіз

Покращений гомеостаз глюкози у мишей, що годували HFD GPR105 KO. (A) Збільшення маси тіла мишей WT та GPR105 KO на NC та HFD (n = 12 на групу). (B) Споживання їжі мишами WT та GPR105 KO на HFD (n = 12). (C.) Тестування на толерантність до глюкози у мишей NC та HFD. Глюкозу (1 г/кг) вводили внутрішньовенно. після 7-годинного голодування і хворову кров збирали для вимірювання глюкози (n = 8). (D) Рівень інсуліну натощак WT та GPR105 KO мишей на NC та HFD (n = 8). (Е) Гостра секреція інсуліну, виміряна у мишей WT, що харчуються HFD, та мишей GPR105 KO у базальних (7 годин швидко) та 15 хв після перорального введення глюкози (n = 8). (F) Тестування на толерантність до інсуліну у HFD мишей. Внутрішньочеревинний інсулін (0,6 ОД/кг) вводили 7-годинним мишам HFD WT та GPR105 KO. Глюкозу в крові вимірювали у зазначені моменти часу. Всі значення виражаються як середні значення ± SEM. * p 473 фосфорилювання Akt, а також загального Akt та HSP90 у печінці, жировій тканині та скелетних м’язах. Тканини збирали до або в зазначений час після ін’єкції інсуліну (0,2 Од/кг) у нижню порожнисту вену.

Покращена чутливість до інсуліну у мишей, що годували HFD GPR105 KO. Чутливість до інсуліну in vivo, що визначається гіперінсулінемічно-евглікемічним затискачем у мишей WT (n = 6) та GPR105 KO (n = 6), яких годували HFD. ГІР (A), НДР (B), IS-NDR (C.), базальний і затиск HGP (D) та придушення HGP (Е) представлені як засоби ± SEM. * p 473 фосфорилювання Akt, а також загального Akt та HSP90 у печінці, жировій тканині та скелетних м’язах. Тканини збирали до або в зазначений час після ін’єкції інсуліну (0,2 Од/кг) у нижню порожнисту вену.

Миші GPR105 KO також продемонстрували значно нижчі показники HGP як в базальному, так і в стаціонарному режимі затискача (рис. 2D), що вказує на те, що здатність інсуліну придушувати HGP була посилена у мишей GPR105 KO, що годувались HFD (рис. 2E). Відповідно до покращеної чутливості до інсуліну печінкової та скелетної мускулатури, виявленої в дослідженнях затискачів, фосфорилювання АКТ значно підвищувалось у тканинах печінки, жирової тканини та скелетних м’язів мишей GPR105 KO після стимуляції інсуліном (рис. 2F). У сукупності ці результати in vivo підтверджують висновок про те, що миші GPR105 KO демонструють поліпшену системну чутливість до інсуліну після HFD із посиленою дією інсуліну в печінці, скелетних м’язах та жировій тканині.

Знижений стеатоз і запалення печінки у мишей GPR105 KO

Вага печінки зменшився у мишей GPR105 KO (рис. 3А), незважаючи на подібну масу тіла мишей GPR105 KO та WT. Миші GPR105 KO також продемонстрували нижчий вміст ТГ у печінці та вміст глікогену (рис. 3B, 3C), а також нижчий ступінь стеатозу печінки за гістологією (рис. 3D).

Зменшена інфільтрація макрофагів та запалення в печінці. Вага печінки (A), TG (B), а також вміст глікогену (C.) у печінці представлені як засоби ± SEM. * p + клітина у відсотках від усіх непаренхімних клітин за допомогою проточної цитометрії. * p + клітини від мишей GPR105 KO (рис. 3G), що відповідає зменшенню запалення печінки. Крім того, експресія генів кількох запальних цитокінів (IL-1β, IL-10, IL-6 та TNF-α) була глибоко знижена в тканинах печінки від мишей GPR105 KO (рис. 3H). Слід зазначити, що синтетаза жирних кислот та карбоксилаза ацетил-КоА були зменшені, тоді як рецептор, активований проліфератором пероксисоми α, дегідрогеназа ацил-КоА середньої ланцюга, рецептор, активований пероксисомним проліфератором γ-коактиватор-1β, фактор транскрипції мітохондрій А та субодиниця 2 цитохрому оксидази були збільшені (рис. 3G), що свідчить про те, що зменшення ліпогенезу та посилення окислення жирних кислот можуть сприяти покращенню стеатозу печінки, що спостерігається у мишей GPR105 KO.

Макрофаги в жировій тканині. (A) вага eWAT у відсотках до загальної маси тіла (n = 8). (B) Експресія GPR105 в адипоцитах та клітинах SVF за допомогою кількісної ПЛР. (C.) Репрезентативні імуногістохімічні зображення eWAT, пофарбовані анти-Mac2 Ab. Шкали шкали, 100 мкм. (D) F4/80 + CD11b + та (Е) F4/80 + CD11b + CD11c + клітини в eWAT, виміряні проточною цитометрією (n = 6). (F) Експресія гена в eWAT. Дані представлені як середні значення ± SD. Показано, що p +, M1-подібні макрофаги секретують прозапальні цитокіни, що знижують чутливість до інсуліну (17, 24). Хоча кількість макрофагів печінки була зменшена, імуногістохімічне фарбування епідидимальної жирової тканини маркером макрофагів Mac2 не показало суттєвих відмінностей у кроноподібних структурах жирової тканини (рис. 4C). Подібним чином, проточна цитометрія не показала відмінностей ні в F4/80 + CD11b + (подвійне позитивне; рис. 4D), ні в F4/80 + CD11b + CD11c + (потрійне позитивне) макрофагів (рис. 4E) в стромальних судинних системах eWAT фракція від мишей GPR105 KO. Ми також не змогли виявити значні зміни в експресії прозапальних генів. Хоча експресія гена IL-1β зменшилася, подібних змін не спостерігалось у експресії гена TNF-α та IL-6 (рис. 4F).

Делеція GPR105 зменшує хемотаксис макрофагів in vivo та in vitro

Оскільки виснаження GPR105 призвело до зменшення кількості макрофагів у печінці, ми далі досліджували, чи можна це явище пояснити зменшенням набору макрофагів проти збільшення обсягу макрофагів. Тому ми провели експеримент з відстеження моноцитів in vivo, щоб оцінити здатність нульових моноцитів WT або GPR105 мігрувати в печінку та жирові тканини. Ми перевірили, що моноцити становлять> 90% популяції WBC після збагачення (Додаткова Рис. 1). Помічені PKH26 моноцити, виділені або GPR105 KO, або мишам-донорам WT, вводили внутрішньовенно. мишам-реципієнтам WT на HFD. Через п'ять днів після ін'єкції клітини, мічені PKH26, у фракції непаренхімних клітин підраховували за допомогою проточної цитометрії. Раніше ми показали, що макрофаги представляють> 90% мічених PKH клітин, рекрутованих до непаренхімної фракції як печінки, так і жирової тканини (25).

Як показано на фіг. 5А, у мишей, які отримували моноцити GPR105 KO, було виявлено менше моноцитів PKH26 + печінки (фіг. 5А). На відміну від цього, відсоток клітин PKH26 + у жировій стромальній судинній фракції не відрізнявся між двома групами (рис. 5В). Ці результати вказують на те, що GPR105 відіграє роль у реакції моноцитів на хемоаттрактні сигнали з печінки, але не з жирової тканини. Більше того, величина зменшення клітин PKH26 + печінки у мишей GPR105 KO припускає, що зменшення клітин F4/80 + печінки (рис. 3G), швидше за все, відображає різницю у вербуванні макрофагів, а не резидентних тканинних макрофагів (клітини Купфера) у HFD- годували мишей GPR105 KO.

Покращений гомеостаз до глюкози та чутливість до інсуліну мишей, пересаджених у кістковий мозок GPR105 KO. (A) Тестування на толерантність до глюкози у мишей WT-BMT та KO-BMT на NC або HFD (n = 12). * p 473 фосфорилювання Akt та HSP90 у печінці, жировій тканині та скелетних м'язах WT-BMT та KO-BMT. Тканини збирали у зазначений час до та після ін’єкції інсуліну (0,2 Од/кг). * p ATM макрофаг жирової тканини BMDM похідний з кісткового мозку макрофаг BMT трансплантація кісткового мозку eWAT епідидимальна біла жирова тканина GDR швидкість утилізації глюкози GIR швидкість інфузії глюкози GPCR G білковий рецептор GTT тест на толерантність до глюкози HFD дієта з високим вмістом жиру HGP вироблення печінкової глюкози IS- GDR стимульований інсуліном GDR ITT тест на толерантність до інсуліну KO нокаут NC нормальний чау 32 PPi [32 P] -пірофосфат RHM завербований печінковий макрофаг TG тригліцерид UDP-Glc уридин 5-дифосфоглюкоза WT дикого типу.