Вплив раннього позбавлення їжі та дієти на транслокацію бактерій із шлунково-кишкового тракту у новонародженої щури

Анотація

Транслокація бактерій визначається як проходження життєздатних бактерій із шлунково-кишкового тракту до мезентеріальних лімфатичних вузлів та інших позакишкових органів, як печінка, селезінка та кров (1). Хоча більшість сучасних знань про транслокацію походять із досліджень на тваринах, зараз широко прийнято вважати, що системне поширення мікроорганізмів з кишечника бере участь у патогенезі тих незрозумілих та потенційно летальних септичних станів, що виникають у пацієнтів із ослабленим імунітетом (2, 3), у пацієнтів з портальною гіпертензією та цирозом печінки (4, 5), а також після великої термічної (6, 7) або механічної травми (8, 9) .

вплив

Інша популяція, схильна до придбання грамнегативного сепсису за відсутності явного фокусу входу, - це новонароджені, особливо недоношені (10). Можливі пояснення цієї унікальної сприйнятливості включають незрілість шлунково-кишкового тракту під час колонізації бактеріями (11) та ще не повністю розвинену імунну систему (12), яка не може повністю очистити проникаючі бактерії. Експериментальна підтримка думки, що транслокація бактерій полегшується, коли кишковий бар’єр незрілий, випливає з досліджень, проведених Glodeта ін. (13) та Плюшке та ін. (14), показуючи, що щеплений перорально Кишкова паличка K1 можна виділити з мезентеріальних лімфатичних вузлів, печінки та крові у новонароджених щурів. Найбільш прямі докази транслокації бактерій у новонароджених людей були, мабуть, отримані Ламбертом-Зеховським та ін. (15), які продемонстрували генетичну спорідненість кількох штамів Клоаки Enterobacter послідовно виділяють із культур стільця, крові та ліквору у немовляти, який мав бактеріємію та менінгіт.

Деякі дані свідчать, що сприйнятливість до поглинання бактерій з кишечника новонароджених може бути додатково посилена шляхом зміни харчового статусу господаря. Клінічні спостереження та епідеміологічні дані добре розуміють, що харчові дефіцити пов’язані зі збільшенням частоти зараження (16). Здається, ця асоціація переважає у штучно вигодованих немовлят, тоді як грудне молоко має певний протиінфекційний ефект (17, 18). Рання харчова депривація, подібно до штучного вигодовування, може змінити проникність та/або архітектуру слизового бар’єру кишечника (19–22), знизити систему імунного захисту господаря (23–25) та порушити нормальний баланс, який існує між різними члени бактеріальної мікрофлори ШКТ (26, 27). Ці зміни були визначені Дейтчем та Бергом (28) для представлення основних факторів ризику транслокації бактерій у дорослих гризунів.

Під час поточних експериментів ми вперше дослідили, чи відбувається транслокація корінних бактерій спонтанно в постпартальний період. Ми також вивчали вплив ранньої дефіцити харчування та режиму годівлі на транслокацію бактерій за допомогою моделей природного та штучного вигодовування. Неонатальних щурів використовували в якості суб'єктів, оскільки ці тварини відносно незрілі при народженні і тому служать зразком для недоношених новонароджених (29, 30) .

МЕТОДИ

Тварини

Вагітних вагітних щурів Sprague-Dawley, що пройшли вагітність, було придбано в селекційних лабораторіях Гімберга, Відень, Австрія. Вони мали вільний доступ до води та регулярні чау-чау, і їх тримали у 12-годинному циклі світло-темно. Щурам дозволялося спонтанно розроджувати. Для цих експериментів використовувались лише народження свідків. Всіх цуценят зважували відразу після пологів.

Експериментальні групи та протокол годівлі

Експеримент I. П'ятдесят шість новонароджених цуценят самців і самок щурів із семи послідів були випадковим чином віднесені до однієї з чотирьох різних груп, щоб виключити вплив варіації інтерлітрів. 1) Щурів вивчали негайно і служили контролем новонароджених (n = 15).2) Щенята щурів залишалися біля дамби і годували їх грудьми ad libitum (n = 15). Дві окремі групи щурів, одну з яких годували грудьми, іншу штучно годували, піддавали обмеженню їжі, щоб викликати недоїдання (31, 32). Графіки годівлі для вираженого недоїдання без високих показників смертності були встановлені в попередніх дослідженнях. ) Цуценятам дозволялося смоктати 30 хв кожні 12 год при щільності 7 щурів на дамбу (n = 13). Між періодами годування дитинчат відокремлювали від дамби і голодували. 3B) Щурів, яких піддавали обмеженому годуванню сумішшю, відразу брали у кожної матері перед початком вигодовування (n = 13). Цуценят годували кожні 6 годин крапельницею з формулою в кількостях, розрахованих для забезпечення споживання енергії 250-300 ккал/(кг · день). Різні годівлі підтримували протягом 5 днів.

Експеримент II. Двадцять сім новонароджених щурів з чотирьох послідів були випадковим чином віднесені до однієї з двох груп: у першій групі щурів годували достатньою кількістю суміші на манометр, розрахованою для забезпечення споживання енергії 500 ккал/(кг · д), як описано в іншому місці ( 30, 33); у другій групі щури смоктали ad libitum біля дамби і були підроблені інтубіровані кожні 6 годин. Щурів аналізували через 3 дні.

Щенята, які не смоктали грудей ad libitum біля дамби розміщувались в окремих чашках з пінополістиролу, що плавали на водяній бані, підтримуваній при температурі 37 ° C. Для імітації материнської діяльності стимулювали сечостатеву область, щоб викликати порожнечі та дефекацію, використовуючи тонку пензлик. Всіх щенят зважували щодня в один і той же час.

Формула молока для щурів (щедро надана Milupa Nutrition Co., Австрія) була складена згідно з опублікованими даними про склад молока щурів (34). Кожні 100 мл містили 175 ккал, 9,6 г білка, 2,9 г вуглеводів і 12,9 г жиру з мінералами та вітамінами, що приблизно відповідає вмісту в молоці щурів. Основними енергозабезпечуючими інгредієнтами дієтичного харчування були кукурудзяна олія (12,7 г/100 мл), казеїнат натрію (7,2 г/100 мл) та лактальбумін (3,2 г/100 мл), подібні тим, що використовували попередні працівники (33, 34). Осмолярність дієти становила 346 мосмоль/л, виміряна депресією точки замерзання (для порівняння, осмоляльність щурячого молока становить 352 мосмоль/л) (34). Молочну суміш готували кожні 12 год із порошкоподібних компонентів. Аликвоти залишкової суміші з кожної 12-годинної порції культивували на кров’яному агарі для виявлення бактеріального забруднення. Усі ці культури були негативними.

Тестування на бактеріальну транслокацію

Морфологія

Двосантиметрові ділянки дистального відділу тонкої кишки від кожного щеня фіксували зануренням у 10% забуференний розчин формальдегіду для світлової мікроскопії. Зразки фарбували гематоксиліном та еозином, трихромом Массона та періодичною кислотою-Шиффом. Усі зразки оцінював один спостерігач, не знаючи про проект дослідження.

Безперервні дані виражаються як середнє значення ± SEM і аналізуються дисперсійним аналізом за Тюкі post hoc тест або непарним двохвостим т тест, за необхідності. Переривчасті дані оцінювали за допомогою аналізу χ 2. стор значення

РЕЗУЛЬТАТИ

Вплив різних годувань на масу тіла.З таблиці 1 видно, що збільшення ваги було подібним, коли грудне молоко або дієти на штучному харчуванні забезпечувались у достатній кількості. Обмежене годування будь-якої дієти призвело до значного уповільнення росту.

Морфологія. Мікроскопічно дистальний відділ кишечника був нормальним у тварин, яких годували нормальним або зменшеним кількістю грудного молока. На відміну від цього, у щурів, яких годували нормальною або обмеженою кількістю суміші, було виявлено дві аномальні ознаки. Підслизовий набряк був постійним виявленням у 4 з 13 нормальних щурів, що годувались сумішшю (стор ТАБЛИЦЯ 2 Бактеріальна колонізація шлунково-кишкового тракту *

Дослідження транслокації. Як показано в таблиці 3, всі бактеріальні культури були негативними у контрольних щурів новонароджених, убитих відразу після народження. Через 5 днів нормального грудного вигодовування бактерії культивували з мезентеріальних лімфатичних вузлів у 27% та з печінки та селезінки у 20% щурів. Подібні результати були отримані при обмеженні вигодовування. Навпаки, обмежене або нормальне годування сумішшю різко збільшило транслокацію бактерій до позакишкових органів, включаючи системну кров, яка залишалася стерильною у всіх інших групах.

У таблиці 4 представлені різні види бактерій, вилучені з брижових лімфатичних вузлів та системних органів. У щурів, яких годували грудним молоком, транслоковані бактерії зазвичай ідентифікували як Ентерокок sp.,Кишкова паличка, і Staphyloccus epidermidis. Ці організми також можна виділити з культур органів щурів, що харчуються сумішшю. Крім того, штучне вигодовування було пов'язане з достатньою транслокацієюПротей sp. і Ентеробактер sp., види, яких не спостерігали в органах тварин, які годували грудьми. Позитивні культури часто вирощували більше одного виду, особливо у щурів, що годувались сумішшю. У всіх окремих цуценят види, вилучені з будь-якої культури органів, були частиною їх кишкової флори.

ОБГОВОРЕННЯ

Наведені тут дані демонструють, що транслокація бактерій з кишечника відбувається спонтанно у щурів новонароджених і різко збільшується при штучному вигодовуванні. Вони також припускають, що обмеження їжі не посилює транслокацію бактерій.

Штучне годування включає кілька особливостей, кожна з яких могла б сприяти транслокації. Це спосіб годування, вплив навколишнього середовища та дієта як такі.

Рівень транслокації залишався низьким після фальшивого обстеження підсосу, що означає, що маніпуляції, пов'язані з методом годівлі, були малоймовірним джерелом транслокації бактерій у щурів, що годувались через зонд. Ще менш імовірно, що транслокація була індукована крапельним методом, який не пов'язаний з потенційною травматизацією слизової оболонки стравоходу та/або шлунка, як годування через зонд. Крім того, бактеріальні культури із суміші були стабільно негативними, що вказувало на те, що бактерії не були посіяні зараженою молочною дієтою. У сукупності підвищений рівень транслокації у штучно вигодованих щурів, швидше за все, не був обумовлений різними методами годівлі.

Два рядки доказів свідчать про те, що вплив штучного вигодовування на транслокацію не було спричинено відокремленням нащадків від дамби та материнського середовища. По-перше, транслокація була набагато вищою у щурів, яких годували обмеженою сумішшю, ніж у щурів, яких годували обмеженим грудним молоком, хоча обидві групи тримали в інкубаторах (за винятком 60 хв на день, протягом яких щурам, що годували груддю, дозволялося смоктати грудь). По-друге, рівні транслокації були кількісно подібними у щурів, яких годували нормальним або обмеженим грудним молоком, незважаючи на те, що перші тварини залишалися біля дамби, а другі тримали окремо від своїх матерів.

На наш погляд, найбільш вірогідною інтерпретацією нинішніх результатів є те, що вплив штучного вигодовування на транслокацію бактерій в основному опосередковується дієтою (та/або відсутністю грудного молока). У штучній суміші відсутні численні антибактеріальні компоненти, присутні в молозиві та грудному молоці щурів та людей, включаючи специфічні гуморальні антитіла, імунокомпетентні клітини та неспецифічні фактори, такі як лізоцим, комплемент та лактоферин (37). Деякі з цих факторів можуть мати місцеві наслідки, коли вони передаються неушкодженими по кишечнику. Наприклад, секреторний IgA являє собою основний захист від прикріплення кишкових бактерій до клітин слизової (38); Ig цієї категорії містяться в грудному молоці у помітних кількостях; однак вони ще не виробляються в незрілій кишці новонародженого (11). У формулі дієти також відсутні фактори, що стимулюють ріст, і гормони, які сприяють нормальному дозріванню слизової оболонки кишечника (39), і, отже, можуть погіршити функцію бар'єру шлунково-кишкового тракту, як це спостерігається у штучно вигодованих новонароджених тварин (21) та людей (22) .

Результати у щурів, які зазнали обмеження в їжі, загалом узгоджуються з дослідженнями на дорослих гризунах, які показують, що недоїдання не сприяє транслокації бактерій (40). Ми не змогли підвищити рівень транслокації обмеженим висмоктуванням, хоча щури, яким піддавались цьому режиму годівлі, постійно не набирали вагу протягом 5-денного періоду. У щурів, яких годували адекватною або обмеженою кількістю суміші, транслокація була збільшена до аналогічного ступеня, хоча перші щури набирали вагу, а другі ні. Оскільки ці дві групи щурів також відрізнялися в інших відношеннях (тобто. спосіб годівлі, підстилка, вік) і оскільки сам по собі набір ваги може не бути ідеальним показником адекватності дієти (34), деякий накладений ефект недоїдання на транслокацію у щурів, що годуються сумішшю, не можна з певністю виключати. Таким же чином, очевидних доказів такого ефекту немає.

Незважаючи на те, що ми не вивчали механізм процесу транслокації, всі основні фактори ризику, згідно з Дейчем і Бергом (28), як зазначено у Вступі, були присутні на штучно вигодованих щурах і могли діяти узгоджено.

По-перше, новонароджена щур є відносно імунодефіцитною при народженні, частково тому, що вона повинна поглинати значну частину свого системного пулу Ig з грудного молока через кишечник. Відсутність грудного молока може ще більше погіршити імунну систему, як уже згадувалося вище.

По-друге, склад бактеріальної мікрофлори шлунково-кишкового тракту порушився і показав підвищений рівень бактеріальної популяції в кишечнику в обох групах цуценят, що годуються сумішшю. Можливі фактори, які могли б змінити бактеріальну флору, включають різницю в харчуванні, зниження моторики та вплив навколишнього середовища. Добре розуміємо, що штучне вигодовування може змінити схему колонізації ШКТ також у немовлят людини, хоча в меншій мірі, ніж ми спостерігали у щурів (27) .

Нарешті, морфологічні зміни слизової оболонки тонкої кишки, що характеризуються набряком субепітелію та нерівними інтерстиціальними крововиливами, були продемонстровані у значної кількості щурів, що годувались сумішшю. Ми припускаємо, що бактеріальні токсини в поєднанні з аномально складеним та посиленим бактеріальним навантаженням, зміненою перистальтикою (41) та гіпоперфузією мікроциркуляції кишечника через септицемію (42) потенційно можуть бути присутніми і могли спричинити ураження слизової оболонки.

Зрозуміло, що нинішні результати у щурів не можуть бути безпосередньо застосовані до ситуації у людини. Тим не менше, наші висновки підтверджують концепцію, що штучне вигодовування може змінити бар'єрну функцію кишечника та полегшити системне вторгнення бактерій з кишечника у незрілого новонародженого.