Вплив прополісу та гамма-циклодекстрину на неоплазію кишечника у нормальної ваги та мишей із ожирінням

Медичний коледж Співдружності, Скрантон, Пенсільванія, 18509

Університет Вілкса, Уілкс-Барре, Пенсільванія, 18766

Медичний коледж Співдружності, Скрантон, Пенсільванія, 18509

Медичний коледж штату Пенсільванія, Герші, штат Пенсільванія, 17033

Медичний коледж Співдружності, Скрантон, Пенсільванія, 18509

Листування

Дарина Л. Лазарова, Медичний коледж Співдружності, Скрантон, Пенсільванія 18509. Тел: 570‐504‐9645; Факс: 570‐504‐9636; Електронна пошта: [email protected]

Медичний коледж Співдружності, Скрантон, Пенсільванія, 18509

Університет Вілкса, Уілкс-Барре, Пенсільванія, 18766

Медичний коледж Співдружності, Скрантон, Пенсільванія, 18509

Медичний коледж штату Пенсільванія, Герші, штат Пенсільванія, 17033

Медичний коледж Співдружності, Скрантон, Пенсільванія, 18509

Листування

Анотація

Вступ

Незважаючи на те, що загальна захворюваність на рак прямої кишки зменшується за останні 35 років, захворюваність зросла серед 20 - 34-річних, і до 2030 року рак раку товстої кишки може зрости до 90% (CC ) захворюваність у цій віковій групі 1. Ця зміна у віці захворюваності частково зумовлена збільшенням ожиріння серед дітей та підлітків 2. Хоча обговорюються механізми ожиріння, схильні до неоплазії кишечника, одна з можливостей полягає в тому, що асоційовані з ожирінням цитокіни (адипокіни) співпрацюють із ініційованими раком мутаціями для підтримки новоутворення в товстій кишці. Жирова тканина та макрофаги, що проникають в цю тканину, секретують високий рівень цитокінів, включаючи TNFalpha, інтерлейкіни та WNT5A, які активують передачу сигналів AKT, ERK, JNK та JAK/STAT. Нещодавно аналіз даних Атласу геномів раку (TCGA) показав, що пацієнти із СД із ожирінням (з індексом маси тіла 30 і більше) мають меншу кількість мутацій генів-водіїв, ніж пацієнти із СК із нормальною вагою 4. Одне з можливих пояснень цього спостереження полягає в тому, що рівні виживання шляхів виживання у людей, що страждають ожирінням, підтримуються новоутвореннями, а не мутаціями генів-драйверів, адипокінами.

Метою нашого дослідження було з'ясувати, чи додаткове новоутворення у мишей, пов'язане з ожирінням, спричиненим дієтою, пригнічується добавкою прополісу. Ми використали Прополіс з Циклопауер (Manuka Health Нова Зеландія), яку ми раніше характеризували в пробірці 14, 16. Ця добавка прополісу складається з олігосахаридом гамма-циклодекстрину; тому олігосахарид був включений в якості контрольної добавки до дієти для втручання.

Матеріали та методи

Тварини

Аналіз тканин

Кишки (тонка кишка і товста кишка) розтинали, фіксували в Histochoice MB (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) протягом 24 год і переносили на 70% етанол. Репрезентативні тканини з ураженнями або без них були заморожені в рідкому азоті. Кишкові новоутворення були підраховані трьома дослідниками, і середня кількість була розрахована на основі цих незалежних підрахунків. Щоб оцінити розмір уражень, знімки зробили на камеру AmScope MA ‐ 1000 на розсікаючому мікроскопі Nikon SMZ645, зображення отримали за допомогою програмного забезпечення Nikon ACT ‐ 1, а розмір (площа поверхні) уражень встановили за допомогою Image J. Щонайменше 70% усіх уражень на кишечник було оброблено для отримання середнього розміру. Для гістологічних досліджень ми використовували методику «швейцарський рулон» для аналізу всієї довжини кишечника 24. Гістопатологічні оцінки базувалися на зафарбованих гематоксиліном та еозином предметних стеклах двох засліплених для патологоанатомів втручання та згідно з номенклатурою кишкової неоплазії у мишей 20. Дисплазію низького та високого ступеня визначали, як рекомендовано номенклатурою кишкової неоплазії на моделях мишей 20 .

Культура клітин та хімічні речовини

Клітинна лінія колоректального раку людини HCT-116, нормальна клітинна лінія клітин товстої кишки плода CCD841CoN та клітинна лінія клітин фібробластів миші 3T3 ‐ L1 були з Американської колекції тканин культури. Клітини вирощували в середовищі альфа-МЕМ з 10% плодовою бичачою сироваткою. Поліпшений прополіс з фенетиловим ефіром кавової кислоти (CAPE) (Прополіс з CycloPower) був подарунком від Manuka Health New Zealand Ltd. для в пробірці досліджень прополіс розчиняли в диметилсульфоксиді при 100 мг/мл; основний розчин витримували при -80 ° C.

Вестерн-блот-аналіз

Секвенування та аналіз екзома

Секвенування екзоми миші проводили на геномній ДНК із тонкої кишки, вкладеної у парафін. Вилучення ДНК, підготовка бібліотеки, захоплення миші Agilent SureSelect (51 Мб); Аналіз екзому платформи HiSeq2500 PE100‐125 та DNAnexus (аналіз In/Del, SNV та CNV) проводили Otogenetics (Norcross, GA). Всі дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення BWA для картографування (для зіставлення послідовностей, що мало розходяться, з великим еталонним геномом) та Набору інструментів аналізу геномів (конвеєр SNP/Indel, програмного забезпечення для аналізу даних про послідовність з високою пропускною здатністю, розробленого в Інституті Броуд). Анотацію однонуклеотидного поліморфізму (SNP) проводили щодо еталонного геному GRCm38/мм10. Шукали базу даних соматичних мутацій щодо мутацій генів, асоційованих з раком (перераховані в COSMIC, каталозі соматичних мутацій раку (http://cancer.sanger.ac.uk/census/).

Статистика

Дані були представлені як середнє значення ± стандартне відхилення (SD). Непарний аналіз t-тесту Стьюдента був використаний для визначення значущості статистичних відмінностей у кількості мутацій між мишами на контрольній дієті та мишами на дієті західного типу. Відмінності вважалися значними на P

Результати

Вага тіла та споживання їжі

Середній приріст маси тіла у мишей, які зазнали контрольної дієти, контрольної дієти з гамма-циклодекстрином та контрольної дієти з добавкою прополісу, був порівнянним (5,8 ± 1,9, 5,9 ± 1,7 та 6,1 ± 0,9 г відповідно, в один бік між групи ANOVA: P = 0,960). Середній приріст маси тіла у мишей, які піддавались західній дієті, західній дієті з гамма-циклодекстрином та західній дієті з добавкою прополісу, становив 9,0 ± 4,3, 9,1 ± 2,0 та 5,2 ± 1,0 грама відповідно в одну сторону між групами ANOVA: P = 0,052 (рис. 1А). Між усіма шістьма групами втручання одностороння ANOVA встановила суттєві відмінності у збільшенні маси тіла [F(5, 26) = 3,2063, P = 0,022]. Споживання їжі було подібним між мишами на контрольній, контрольно-циклодекстриновій та контрольно-прополісовій дієтах (10,3, 8,8 та 8,3 ккал/миша/день відповідно). Подібним чином споживання їжі суттєво не відрізнялося між мишами на західній дієті, західній дієті з гамма-циклодекстрином або західній дієті з прополісом (14,6, 13,0, 14,0 ккал/миша/день відповідно).

Неопластичне навантаження: кількість і розмір новоутворень в кишечнику

При аналізі всіх шести втручань, на додаток до вищезазначених відмінностей між кожними трьома методами лікування (в контексті контролю або західної дієти), пост-хок-тест Тукі з урахуванням 95% впевненості виявив відмінності (P 2), середній (5–10 мм 2) і великий (> 10 мм 2). Ця категоризація обґрунтована діапазоном уражень середнього розміру в усіх шести групах втручання (діапазон визначався найменшим розміром 4,6 ± 0,8 мм 2, виявленим у мишей, які годували західну дієту гамма-циклодекстрином, та найбільшим розміром 8,0 ± 0,7 мм 2 у мишей, які харчуються західною дієтою). Відсоток новоутворень середнього розміру (5–10 мм 2) не відрізнявся статистично значущим чином між шістьма дієтичними втручаннями [F(5, 26) = 0,4325, P = 0,822] (рис. 2Б). Однак відсоток малих і великих аденом виявляв зворотну кореляцію з розміром уражень (рис. 2А, С). Групи, які приймали доповнені контрольні та західні дієти, демонстрували більшу кількість малих (2, рис. 2А) новоутворень та меншу кількість великих (> 10 мм 2, рис. 2С) новоутворень порівняно з відповідними дієтами без добавок.

Аналіз відсотка новоутворень з площею поверхні більше 10 мм 2 (рис. 2С) виявив значну різницю між шістьма групами втручання [F(5, 26) = 3,0335, P = 0,028]. Постійний тест Тукі встановив, що відсоток великого (> 10 мм 2) новоутворення був вищим у мишей, які харчувалися західною дієтою без добавок (23,5 ± 9,8%), порівняно з відсотком великих новоутворень у мишей, які отримували контрольну дієту з добавкою прополісу ( 8,2 ± 6,5%, P = 0,043) (W проти CP, рис. 2C). Крім того, відсоток великого (> 10 мм 2) новоутворення був вищим у мишей, які харчувалися західною дієтою без добавок (23,5 ± 9,8%), порівняно з мишами, які годували західну дієту гамма-циклодекстрином (11,8 ± 8,1%, P = 0,034) (W проти WD, рис. 2C). Аналіз відсотка новоутворень менше 5 мм 2 також виявив значну різницю між шістьма групами втручання [F(5, 26) = 2,6228, P = 0,048] (рис. 2А). Постійний тест Тукі показав, що відсоток малих (2) новоутворень був нижчим у мишей, які харчувалися західною дієтою без добавок (42,3 ± 10,6%), порівняно з відсотком дрібних новоутворень у мишей, які отримували контроль з добавкою прополісу (64,8 ± 8,2%, P = 0,030) (W проти CP, рис. 2А).

Ступінь ураження кишечника

Молекулярні дослідження

Серед трьох груп втручання на західній дієті розмір новоутворень статистично відрізнявся у мишей на західній дієті, доповненій гамма-циклодекстрином. Ми з'ясували, чи обумовлений цей ефект здатністю гамма-циклодекстрину модифікувати шляхи виживання в кишкових новоутворених тканинах. Вестерн-блот-аналіз за допомогою нормальних та новоутворених тканинних лізатів не виявив послідовних змін рівнів Akt/pAkt, Stat3/pStat3, Erk/pErk та c-Jun/pc-Jun (дані не наведені). Далі ми перевірили, чи менший розмір та менша кількість новоутворень у мишей, які годували західну дієту гамма-циклодекстрином, зумовлені вищим апоптозом у кишкових тканинах. Рівні проапоптотичного білка Bax та розщепленої Каспази 3 (ознака апоптозу) були підвищені в тканинах мишей на західній дієті з гамма-циклодекстрином (рис. 4А).

Ще одне наше спостереження в природних умовах Аналізи показали, що миші, які сидять на західній дієті з прополісом, не набирали маси тіла в тій же мірі, як миші, які годували західну дієту або західну дієту гамма-циклодекстрином (рис. 1А). Щоб пояснити це спостереження на молекулярному рівні, ми проаналізували основні сигнальні шляхи, пов'язані з ожирінням, у тканинах білого жиру епідидиму мишей, яких годували західними дієтами з добавками або без них. Вестерн-блот-аналізи виявили зниження рівня pErk1/2 у тканинах білого жиру епідидиму мишей, які харчувались вестерн-дієтою прополісом (рис. 4В); однак не відбулося послідовних змін рівнів Akt/pAkt, Stat3/pStat3 та pc-Jun/c-Jun (дані не наведені). Раніше ми повідомляли, що прополіс гіперактивує передачу сигналів ERK в клітинах CC в пробірці 16. Щоб усунути цю невідповідність, ми проаналізували реакцію на прополіс у двох нормальних клітинних лініях: мишачий фібробласт 3T3 ‐ L1 та кишковий епітеліальний кишковий CCD841CoN. Як ми повідомляли, прополіс підвищував рівень pERK1/2 у клітинах колоректальної карциноми HCT ‐ 116; однак рівень pERK1/2 знижувався в нормальних клітинах (рис. 4С).

Мутаційний профіль новоутворення у мишей на контрольній та західній дієті

Обговорення

Ожиріння є зростаючою проблемою охорони здоров’я, оскільки воно є фактором ризику для 10 типів раку 5, 27, включаючи КК; однак механізми цієї асоціації досі незрозумілі 4, 28. Це дослідження є першим поступальним кроком, який слідує за нашим в пробірці висновки про те, як прополіс модулює клітини CC 14, 16, і він був розроблений для визначення того, чи впливає прополіс на кишковий неопластичний розвиток в природних умовах, в контексті нормальної ваги та ожиріння.

Серед груп мишей на контрольних дієтах, групи, що зазнали дії добавок, гамма-циклодекстрину та прополісу, знизили прогресування новоутворень, що визначається середнім розміром та кількістю всіх уражень, а також ступенем дисплазії. Статистично значуще зменшення кількості аденом було виявлено у мишей, які отримували контрольну дієту з доповненням прополісом, порівняно з мишами, які отримували контрольну дієту без добавок. У порівнянні з мишами на контрольній дієті без добавок, миші, які годували контрольну дієту гамма-циклодекстрином, також виявляли зменшення кількості уражень та ступеня дисплазії; однак ці відмінності не були статистично значущими.

Серед трьох груп втручання на західній дієті відмінності в кількості новоутворень не були статистично значущими; тоді як різниця у розмірі новоутворень була статистично значущою. Групою з найменшим числом/розміром аденоми та найбільшим відсотком уражень з низьким ступенем дисплазії була група на західній дієті, доповнена гамма-циклодекстрином. Група західної дієти з прополісом також демонструвала статистично значуще зменшення розмірів новоутворень у порівнянні з групою мишей, які сиділи на західній дієті без добавок.

Гістопатологічна оцінка новоутворень показала, що пошкодження великих розмірів у мишей, які годували західною дієтою, корелювали з більш швидким прогресуванням; лише новоутворення у цих мишей виявляли вогнищевий некроз. З іншого боку, найнижча частота пухлинного прогресування у мишей, які харчувалися західною дієтою, доповненою гамма-циклодекстрином, була засвідчена не тільки найменшим числом і найменшим розміром новоутворень, але також гістологічною оцінкою тканин. Ця знахідка збігається з спостереженням підвищеного рівня апоптотичних маркерів у кишкових тканинах мишей, які харчуються західною дієтою гамма-циклодекстрином. У кишечнику гамма-циклодекстрин може ферментуватися до коротколанцюгових жирних кислот, включаючи бутират 30, і при застосуванні в пробірці, бутират індукує апоптоз у клітинах з мутаціями, що активують передачу сигналів WNT/бета-катеніну, такими як мутації в Apc ген 10. Отже, посилений апоптоз у кишкових тканинах мишей на дієті з добавкою циклодекстрину може бути зумовлений апоптотичними ефектами бутирату.

Більш швидке прогресування новоутворень у мишей із ожирінням, які харчуються західною дієтою, могло бути наслідком вищої частоти мутацій, збільшення кількості стовбурових клітин та відділів стовбурових клітин, підвищення рівня адипокінів, епігенетичних змін та змін мікробіоти кишечника Деякі з цих можливостей були розглянуті шляхом аналізу послідовності екзомів нормальної ваги (контрольна дієта) та мишей із ожирінням (західна дієта). Хоча середній розмір пухлинних уражень у мишей із ожирінням був більшим, ніж у мишей із звичайною вагою, кількість та тип генів, на які впливали мутації середнього та сильного впливу, були меншими у людей з ожирінням. Цей результат підтверджує наші висновки про те, що в порівнянні з пацієнтами із нормальною вагою, геноми раку у хворих на СК із ожирінням мають менше соматичних мутацій і відповідно меншу кількість мутацій в генах-драйверах Аналіз послідовності не виявив стійких відмінностей у типі уражених генів. Це могло бути пов'язано з тим, що неопластичний розвиток у нашому експерименті обмежився стадією прекарциноми; тоді як аналіз людського екзому проводили на даних стадії III карциноми товстої кишки з TCGA. Однак наявність множинних мутацій навіть на ранній стадії аденоми вже підтверджена у людей 36, 37 .

Подяки

Це дослідження фінансувалось за рахунок гранту на дослідження від Manuka Health New Zealand Ltd та дослідницьких фондів TCMC. Ми вдячні доктору А. Саддесу з Manuka Health New Zealand Ltd за надання Прополіс з Циклопауер для наших досліджень, а Віктор Меллорі за турботу про мишей.