Вплив піоглітазону на неалкогольну хворобу жирової печінки за відсутності вираженої експресії рецептора андростану

1 кафедра внутрішньої медицини, медичний коледж університету Чунг-Ан, 102, Heukseok-ro, Dongjak-gu, Сеул 06973, Республіка Корея

2 Інститут біомедичних досліджень Національної університетської лікарні Сеула, 101, Daehak-ro, Jongno-gu, Сеул 03080, Республіка Корея

3 Доклінічний експериментальний центр, лікарня Бунданг Національного університету Сеула, 82, Гумі-ро 173 Беон-Гіл, Бунданг-гу, Соннам-сі, Кьонгі-до 13620, Республіка Корея

4 Центр клінічних випробувань, лікарня Severance, система охорони здоров'я університету Йонсей, 50-1, Yonsei-ro, Seodaemun-gu, Сеул 03722, Республіка Корея

5 Департамент внутрішніх хвороб Сеульського національного університету, Медичний коледж, 101, Daehak-ro, Jongno-gu, Сеул 03080, Республіка Корея

Анотація

1. Вступ

Безалкогольна жирова хвороба печінки або стеатогепатит (НАЖХП/НАСГ) - це жирова хвороба печінки, спричинена ожирінням, спричиненим дієтою. Нещодавнє епідеміологічне дослідження повідомило, що поширеність НАЖХП становить 25,24% у всьому світі та 7,6% серед дітей [1]. Ожиріння, цукровий діабет 2 типу та дисліпідемія тісно пов’язані з НАЖХП [2] та сприяють прогресуванню захворювання до фіброзу та цирозу печінки [3]. Інсулінорезистентність є загальновизнаним фактором ризику розвитку НАЖХП [4]. Гіперінсулінемія, що виникає внаслідок резистентності до інсуліну, збільшує не лише синтез ліпідів, але й поглинання жирних кислот гепатоцитами через посилений ліполіз адипоцитів [2]. Втручання у спосіб життя (дієта та фізичні вправи) та фармакологічні методи лікування, такі як вітамін Е, піоглітазон та пентоксифілін, використовуються для лікування НАЖХП [3].

Серед цих препаратів в деяких дослідженнях на людях було показано, що піоглітазон покращує НАЖХП [5, 6]. Піоглітазон також знижує рівень глюкози натще і після їжі за рахунок поліпшення чутливості до інсуліну при цукровому діабеті 2 типу [7] і в даний час використовується як протидіабетичний препарат. Піоглітазон діє, зв'язуючись з гамма-рецептором, що активується проліфератором пероксисоми (PPARγ), член надсімейства ядерних рецепторів, який відіграє ключову роль у регуляції глюкози та ліпідному обміні [8]. Піоглітазон широко метаболізується шляхом гідроксилювання та окислення в печінці з утворенням принаймні чотирьох первинних метаболітів (M-I, M-II, M-IV та M-V) та двох вторинних метаболітів (M-III та M-VI) [9]. Фармакологічно активні M-IV та M-III є основними метаболітами, що містяться в сироватці крові людини.

Піоглітазон метаболізується множинними ферментами цитохрому P450 (CYP), головним чином CYP2C8, CYP3A4 та CYP2C9 [9, 10], які регулюються конститутивним андростановим рецептором ксенобіотичних рецепторів (CAR) [11]. Попередні дослідження показали, що CAR може спричинити різницю в ефективності ліків, змінюючи ступінь метаболізму ліків. Наприклад, метаболізуючий ацетамінофен фермент CYP1A2, CYP3A11 та глутатіон S-трансферази активуються CAR-залежним чином після лікування ацетамінофеном у мишей дикого типу та викликають гепатотоксичність, але не у нульових мишей CAR [12]. Отже, активність CAR може впливати на метаболізм піоглітазону, а ефекти піоглітазону можуть змінюватися залежно від ступеня метаболізму.

Крім того, активність CAR впливає на стеатоз печінки. Стимуляція експресії CAR агоністом CAR (TCPOBOP) зменшила стеатогепатит у мишей, що харчуються дієтичним харчуванням метіоніном [13]. CAR є членом підродини NR1; кілька інших ядерних рецепторів, таких як рецептор прегнану X; PPARα, β, γ; Х-рецептори печінки α, β; і рецептор фарнезоїду X α також є членами підродини NR1 і пов'язані з патогенезом НАЖХП [14]. Таким чином, на міжіндивідуальні відмінності в дії піоглітазону на НАЖХП можуть впливати активність CAR та взаємодія між кількома генами.

У цьому дослідженні ми припустили, що на вплив піоглітазону на НАЖХП впливає активність CAR. Щоб підтвердити цю гіпотезу, ми дослідили вплив делеції CAR на зміни НАЖХП та пов'язану експресію генів, індуковану піоглітазоном у печінці миші.

2. Матеріал і методи

2.1. Тварини та досліджувані наркотики

Мишей CAR +/+ (дикого типу, C57BL/6J) постачала компанія Orient Bio, Inc. (Соннам, Корея). Мишей дикого типу розділили на дві групи (контроль проти активації CAR). Для індукції активації CAR, один раз на тиждень вводили внутрішньоочеревинну ін'єкцію 3 мг/кг TCPOBOP (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США). Гомозиготних мишей, що нокаутували CAR (CAR -/-), генерували шляхом генного націлювання, як описано раніше [15], а потім повторно перетинали мишей C57BL/6J до десятого покоління. Їх повторно перетинали на мишах CAR +/+ C57BL/6J (Orient Bio) і використовували як контролі. Мишей утримували при температурі навколишнього середовища (23 ± 1 ° C), з 12: 12-годинними циклами світло-темрява та доступом до води ad libitum.

У звичайній дієті чау (лабораторна чау-чау 38057, Пурина Корея, Сеул, Корея) та дієті з високим вмістом жиру (дієта 60 ккал% жиру, D12492, Research Diets, Inc., Нью-Брансвік, Нью-Джерсі, США), стан годування, 8 –10-тижневих самців CAR +/+ (контрольних та оброблених TCPOBOP) та CAR -/- мишей призначали до носіїв або груп лікування відповідно до введення піоглітазону гідрохлориду (Takeda Chemical Industries, Осака, Японія). Піоглітазон гідрохлорид вводили по 10 мг/кг/день перорально, змішуючи з дієтою протягом 12 тижнів. Кожна експериментальна група включала принаймні 4 миші, і експеримент повторювали 3 рази.

Під час введення різних концентрацій піоглітазону гідрохлориду (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Санта-Крус, Каліфорнія, США) мишам CAR +/+ та CAR -/- (1, 3, 10, 20 або 30 мг/кг), піоглітазон вводили з використанням зонда один раз на день протягом 14 днів. Піоглітазон гідрохлорид розчиняли в Solutol HS-15 (9% у сольовому розчині, забуференному фосфатом). Подібні концентрації піоглітазону в сироватці були виявлені, коли ми вводили різну концентрацію піоглітазону мишам CAR +/+ (10 і 20 мг/кг) та мишам CAR -/- (1 та 3 мг/кг).

Для виявлення короткочасних змін експресії генів після лікування піоглітазоном ми провели короткочасний (6 год) експеримент. Мишей розділили на 4 групи мишей CAR +/+ та CAR -/- залежно від того, чи вводили піоглітазон та/або ліпід. По три миші були включені в кожну групу. Піоглітазон гідрохлорид (20 мг/кг) та 3 г/кг 20% інтраліпіду (ін’єкція LIPO MCT, Dongkook Pharmaceutical Co., Chungbuk, Корея) вводили шляхом внутрішньочеревної ін’єкції.

Всіх тварин забивали після голодування протягом 6 год, починаючи з 06:00 ранку. Мишей знеболювали внутрішньочеревною ін’єкцією Zoletil® (Virbac, Carros, Франція), а загальний жир вимірювали за допомогою аналізатора складу дрібних тварин PIXImus (GE Healthcare, Little Chalfont, Великобританія). Печінку швидко видаляли, зважували і заморожували в рідкому азоті для вилучення РНК. Білий і коричневий жир також видаляли, зважували і заморожували в рідкому азоті. Протокол дослідження був затверджений Інституційним комітетом з догляду та використання тварин у лікарні Бунданг Національного університету Сеула, Соннам, Республіка Корея (BA1012-074/068-1).

2.2. Вимірювання маси тіла та толерантності до глюкози

Вагу тіла контролювали щотижня. Споживання їжі вимірювали кожні 3 дні. Рівень глюкози в крові перевіряли за допомогою смужок реагентів, зчитуваних у глюкометрі (ACCU-CHEK Active, Рош, Мангейм, Німеччина). Внутрішньочеревинний тест на толерантність до глюкози проводили через 12 год голодування шляхом внутрішньочеревної ін’єкції 1 г/кг глюкози через 12 тижнів після експериментів. Рівні глюкози в крові в хвості вени крові визначали за допомогою глюкометра до і через 15, 30, 60, 90 та 120 хв після ін'єкції глюкози.

2.3. Вимірювання ліпідного профілю та інсуліну

Загальний холестерин, тригліцериди, ліпопротеїни високої щільності та холестерин ліпопротеїдів низької щільності визначали за допомогою автоматичної системи біохімічного аналізу Beckman Coulter AU480 (Brea, CA, USA) із наборами реагентів, наданими виробником. Для екстракції ліпідів тканини промивали крижаним PBS для ретельного видалення надлишків крові та дрібних шматочків та гомогенізували їх у 100-200μL PBS зі скляним гомогенізатором на льоду. Отриману суспензію зберігали протягом ночі при -20 ° C. Для подальшого прориву до клітинних мембран було проведено два цикли заморожування-відтавання. Після цього гомогенати центрифугували протягом 5 хвилин при 5000 х

. Надосадову рідину використовували для аналізу. Для аналізу використовували набір тригліцеридів ELISA (Aviva Systems Biology, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) та набір для аналізу загального холестерину (BioVision Inc., Milpitas, CA). Інсулін вимірювали за допомогою мишачого інсулінового набору ELISA (ALPCO Diagnostics, Windham, NH, USA) згідно з протоколом виробника.

2.4. Гістологічний аналіз

Ліві частки печінки видаляли, промивали PBS, фіксували в 10% розчині формальдегіду-PBS і вкладали у парафін. Тканини перерізали на 5 μм товщиною і фарбують гематоксиліном та еозином.

2.5. Вимірювання концентрації піоглітазону

Концентрації піоглітазону аналізували за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (серія Agilent 1200, Agilent Technologies, Санта-Клара, Каліфорнія, США). Піоглітазон гідрохлорид розводили у 50% ацетонітрилі, отримуючи 100 μг/мл робочого розчину. Цей робочий розчин розбавляли порожньою плазмою для приготування стандартних розчинів різної концентрації (5, 10, 50, 100, 500, 1000 та 2000 нг/мл). Цей стандартний розчин (0,2 мл) змішували з 10 μL з 1 μЛ/мл формотеролу та 600 μL ацетонітрилу і потім центрифугували протягом 5 хв при 13 226 х. Далі, 100 μг/мл супернатанту змішували з 500 μL 5 мМ формату амонію: ацетонітрил (20:80, 0,1% трифтороцтова кислота). Ця суміш (0,1 μL) піддавали рідинної хроматографії-мас-спектрометрії/мас-спектрометрії і графіки аналізували.

2.6. Виділення РНК та кількісна ПЛР у реальному часі

2.7. Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили непараметричним аналізом за допомогою критерію Манна – Уітні. Статистична значимість передбачалася на P +/ + та CAR -/- миші (Малюнок 1 (а)). Відсоток загального жиру в організмі був збільшений у мишей CAR +/+, оброблених піоглітазоном, але цей ефект було скасовано шляхом делеції CAR (Малюнок 1 (b)). Кількість споживання їжі між групами була однаковою (дані наведені). Вага печінки не відрізнялася між групами (рис. 1 (в)). Хоча рівень інсуліну натще не показав суттєвої різниці (рис. 1 (d)), лікування піоглітазоном суттєво пригнічувало підвищення рівня глюкози в крові у всі часи у мишей CAR -/- та суттєво підвищувало рівень глюкози в крові у групи мишей CAR +/+, крім протягом 120 хв після навантаження глюкозою (рис. 1 (е)). Рівень загального холестерину та ліпопротеїдів високої щільності в сироватці крові був значно вищим у мишей CAR -/-, ніж у мишей CAR +/+. Однак суттєвих змін ліпідних профілів після лікування піоглітазоном не спостерігалося (рис. 1 (f)). Після лікування піоглітазоном рівень холестерину та тригліцеридів печінки також не відрізнявся (рисунок 1 (g)).