Визначення молекулярної маси білка за допомогою SDS-PAGE: Огляд процесу

Питання:

Як визначити молекулярну масу білка за допомогою SDS-стор?

визначення

Людина з білками каже:

Як ви можете оцінити молекулярну масу невідомого білка? Ну, ви можете зробити це, використовуючи метод SDS-PAGE (електрофорез у додецилсульфаті натрію в поліакриламідному гелі). Хоча існують деякі інші методи (наприклад, аналітичне ультрацентрифугування та розсіювання світла) для розрахунку розміру або молекулярної маси (МВт) невідомого білка, вони зазвичай не використовуються для цієї мети, оскільки використовують велику кількість високоочищених білків і вимагають дорогого обладнання.

SDS-PAGE для визначення молекулярної маси: огляд процесу

Щоб визначити молекулярну масу невідомого білка, слід розділити зразок на одному і тому ж гелі з набором стандартів молекулярної маси. Після запуску стандартів та невідомого зразка білка гель обробляють необхідним плямою, а потім знебарвлюють протягом приблизно 12-14 годин для візуалізації білкових смуг.

Після запуску гелю слід визначити відносну відстань міграції (Rf) білкових стандартів та невідомого білка. Відстань міграції можна визначити, використовуючи таке рівняння:

Rf = відстань міграції білка
Міграційна відстань фронту барвника

Примітка: Ви можете за допомогою лінійки виміряти відстань міграції (у сантиметрах) від верхньої частини гелю до кожної основної смужки гелю. В якості альтернативи, відповідне програмне забезпечення може також використовуватися для визначення значень Rf результуючих смуг.

На основі значень, отриманих для смуг у еталоні, логарифм молекулярної маси денатурованого SDS-поліпептиду та його відносної відстані міграції (Rf) наноситься на графік. Зверніть увагу, що ви отримаєте лінійний графік для більшості білків, якщо ваші зразки повністю денатуровані, а відсоток гелю відповідає діапазону молекулярної маси зразка. Якщо ви отримаєте сигмоїдальну криву, це означає, що ефект просіювання вашої матриці або занадто великий, що обмежує проникнення молекул у гель, або майже незначний, що дозволяє молекулам білка мігрувати майже при вільній рухливості.

Інтерполяція значення з цього графіку надасть вам молекулярну масу невідомої смуги білка. Зверніть увагу, що точність цього методу при визначенні молекулярної маси невідомого білка зазвичай становить від 5% до 10%. Наявність таких поліпептидів, як гліколь- та ліпопротеїди, як правило, призводить до помилкових результатів, оскільки вони не повністю покриті SDS і, отже, не будуть вести себе належним чином.

Отже, для прикладу на малюнку невідомий білок має Rf 0,7084. Використовуючи рівняння для лінійного графіку, ми можемо розрахувати Log (МВ). (-2,0742 х 0,7084) +2,8 = 1,3305. Отже, обернений логарифм дорівнює 10 ^ 1,3305 = 21,4 кДа для молекулярної маси невідомого білка.

Створення ідеальних умов розділення: деякі фактори, які слід врахувати

Враховуючи його важливість у визначенні молекулярної маси невідомого зразка білка, під час експерименту потрібно вибрати відповідні умови поділу. Для цього потрібно взяти до уваги наступні фактори:

Стандартний білок та невідомий білок повинні бути електрофорезовані на одному і тому ж гелі за однакових умов.

Слід створити кілька точок даних, щоб переконатися, що дані мають статистичну значимість. Для досягнення найкращих результатів спробуйте використовувати принаймні три гелі.

При солюбілізації білків буфер зразків повинен містити відновники, такі як дитиотреїтол або В-меркаптоетанол, щоб забезпечити розрив дисульфідних зв’язків. Як ви вже знали, дисульфідні зв'язки зменшують вплив вторинної структури на міграцію.

Буфер зразка також повинен містити SDS. SDS зв'язується з гідрофобними білковими областями, денатуруючи вторинні, третинні та четвертинні структури і дає чистий негативний заряд на білки. SDS призводить до того, що білки розгортаються до випадкових, схожих на палички ланцюгів, не порушуючи при цьому ніяких ковалентних зв’язків. Це змушує білки втрачати свої біологічні функції, не пошкоджуючи їх первинних структур.

Майте на увазі, що невідомий білок повинен знаходитися в лінійному діапазоні стандартної кривої, щоб забезпечити точне визначення його молекулярної маси. Крім того, кількість невідомого білка повинна відповідати відповідному стандарту для підвищення точності результатів.