Виразна метаболічна адаптація печінкових циркадних шляхів до гострої та хронічної структури прийому алкоголю

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

Відредаговано Бен Гао, Національним інститутом зловживання алкоголем та алкоголізмом, Бетесда, доктор медичних наук, та прийнято членом редакційної комісії Джозефом С. Такахасі 28 жовтня 2019 р. (Отримано на огляд 1 липня 2019 р.)

Значимість

Вживання алкоголю є широко розповсюдженою звичкою в сучасному суспільстві і може спричинити шкідливі метаболічні наслідки. Недавні дослідження виявили взаємозв'язок між харчуванням, метаболізмом та циркадними ритмами. Тут ми досліджуємо вплив вживання алкоголю на циркадну фізіологію. Ми застосували неупереджену високопродуктивну протеоміку, ацетиломіку та циркадну транскриптоміку, щоб забезпечити всебічний аналіз метаболізму печінки та порівняти результати гострого та хронічного вживання алкоголю. Ми виявляємо, що різні закономірності споживання алкоголю диференційовано перепрограмують експресію циркадних генів у печінці. Зокрема, перепровід циркадних шляхів SREBP впливає на субклітинне розподіл ацетилювання білка через метаболізм ацетил-КоА. Ці результати сприяють розумінню основного механізму алкогольної хвороби печінки та встановленню цілодобових терапевтичних цілей та стратегій.

Анотація

Випивка і хронічний вплив етанолу сприяють алкогольним захворюванням печінки (АЛД). Потенційний зв'язок між ALD та циркадними порушеннями спостерігався, хоча те, як різні типи вживання алкоголю різним чином впливають на печінковий циркадний метаболізм, залишається практично не вивченим. Використовуючи гостре проти хронічного годування етанолом, ми виявляємо диференційне перепрограмування циркадного транскриптома в печінці. Зокрема, повторне підключення денного транскрипційного шляху SREBP призводить до чітких печінкових ознак в метаболізмі ацетил-КоА, які транслюються в субклітинні структури ацетилювання білка. Таким чином, різні типи вживання алкоголю диктують диференційну адаптацію печінкового циркадного обміну.

Вживання алкоголю - звична звичка в сучасному суспільстві. Пияцька поведінка, така як звичне пияцтво, алкогольна залежність і навіть запої в одному епізоді може спричинити несприятливі наслідки для здоров'я та соціальну та економічну шкоду (1). Алкогольні захворювання варіюються від нервово-психічних розладів до раку та серцево-судинних захворювань (1) із суттєво різними наслідками залежно від кількості та закономірностей вживання алкоголю (1, 2). До додаткових факторів належать вік, стать, соціально-економічний статус та країна (1, 3), що підкреслює важливість розуміння того, як гострі та хронічні особливості споживання алкоголю можуть спричинити захворювання, пов’язане з алкоголем.

В основному метаболізуючись у печінці, алкоголь є важливим фактором ризику розвитку алкогольних захворювань печінки (АЛД), ступінь тяжкості якого варіюється від стеатозу (жирова печінка), алкогольного гепатиту (поєднання стеатозу та запалення) та фіброзу до цироз та гепатоцелюлярна карцинома (2, 4). У патогенезі ALD повідомлялося про декілька основних молекулярних механізмів, таких як окислювальний стрес, запалення та клітинні пошкодження (2, 4, 5). Більше того, додаткові фактори ризику пов'язані з прогресуванням АЛД, включаючи ожиріння та куріння (5). Метаболічно, етанол окислюється до ацетальдегіду NAD + -залежною спиртовою дегідрогеназою або мікросомальною CYP2E1 і далі окислюється до ацетату NAD + -залежною альдегіддегідрогеназою (2, 6). В результаті зниження співвідношення NAD +/NADH окислення ліпідів послаблюється, що призводить до стеатозу печінки (5, 7). Крім того, ацетальдегід, отриманий етанолом, інактивує печінковий рецептор-α, активований проліфератором пероксисоми (PPAR-α), сприяючи пригніченню окислення жирних кислот мітохондрій (8).

Нові факти свідчать про взаємний зв’язок між циркадними ритмами та алкогольним обміном (9). Миші на 2 мутантів демонструють збільшення споживання алкоголю через глутаматергічну систему мозку (10). Більше того, викликаний алкоголем витік кишечника погіршується порушенням роботи годинника, сприяючи прогресуванню БАС, що свідчить про те, що годинник бере участь не лише у поведінці вживання алкоголю, а й у патології алкогольних захворювань (11). Хронічний вплив етанолу порушує ритмічну експресію генів Pomc та Per у дугоподібному ядрі та годинникових генах у печінці, але не в супрахіазматичному ядрі (12 ⇓ –14). Ритмічність NAD +/NADH також скасовується споживанням етанолу, тоді як етанол викликає коливання рівня холестерину та жовчних кислот у печінці (14). Цікаво, що ацетилювання печінкових ферментів, що беруть участь в метаболізмі етанолу, виявляє циркадну ритмічність, що свідчить про важливість метаболізму ацетил-КоА у перепрограмуванні печінкового циркадного метаболізму (15).

Ми застосували неупереджену високопродуктивну протеоміку, ацетиломіку та циркадну транскриптоміку, щоб з’ясувати взаємодію між циркадним метаболізмом та споживанням алкоголю в печінці. Виразні ритмічні шляхи транскрипції причетні до гострого або хронічного споживання етанолу. Серед цих шляхів транскрипція, керована SREBP, як видається, по-різному реагує на різні рівні та моделі споживання алкоголю. Як наслідок, печінкове переключення метаболізму ацетил-КоА перетворюється на специфічні сигнатури при ацетилюванні цитозольних та мітохондріальних білків. Таким чином, наше дослідження виявляє, як індуковане алкоголем диференціальне переключення циркадної транскрипції метаболічно перетворюється на різні закономірності ацетилювання білка через метаболізм ацетил-КоА і тим самим дає уявлення про патофізіологію ALD.

Результати

Хронічне вживання алкоголю порушує циркадний метаболізм та поведінку.

Виразні циркадні шляхи шляхом гострого та хронічного годування алкоголем. (A) Аналіз генної онтології, що показує 5 найкращих біологічних процесів, збагачених ритмічними генами, що коливаються лише в групах A-Ctrl та A-EtOH, із числом генів, вказаним на графіку. (B) Аналіз генної онтології, що показує 5 найкращих біологічних процесів, збагачених ритмічними генами, що коливаються лише в групах C-Ctrl і C-EtOH, із зазначенням кількості генів на графіку. (C) Діаграма Венна, що відображає кількість коливальних генів у гострій та хронічній групах Ctrl (зверху), гострих та хронічних групах EtOH (середня) та обох групах при гострих та хронічних методах лікування (знизу). (D) Аналіз онтології генів, що показує метаболічні процеси ліпідів, збагачені ритмічними генами, що коливаються лише в групі A-Ctrl, A-EtOH, C-Ctrl або C-EtOH.

Грунтуючись на можливих змінах метаболічних шляхів ліпідів, запропонованих аналізом метаболічної клітини, ми далі зосередились на біологічних процесах, що беруть участь в ліпідному обміні (рис. 3D). Примітно, що метаболізм жирних кислот збагатився гострим EtOH та хронічною печінкою Ctrl, тоді як метаболізм холестерину збагатився хронічною печінкою EtOH, що свідчить про те, що алкоголь різним чином регулює метаболізм ліпідів залежно від дози та періоду лікування (рис. 3D). Підтримуючи це поняття, було виявлено відносно невелике перекриття циклічних генів між гострим та хронічним EtOH (рис. 3С). В цілому ці дані вказують на те, що різні режими етанолу диференційовано переробляють циркадну фізіологію печінки.

Диференціальна реакція на транскрипцію, яка залежить від SREBP, на гострий і хронічний прийом етанолу.

Для розшифрування шляхів транскрипції, викликаних етанолом, на циркадних транскриптах було проведено аналіз ділянки зв'язування фактора транскрипції (TFBS) за допомогою MotifMap, а подальший мета-аналіз був використаний для ідентифікації пов'язаних факторів ритмічної транскрипції (TF) для кожного стану (рис. 4 A та Б) (29, 30). Цікаво, що SREBP1 та його мотив зв'язування були дуже збагачені в гострих та хронічних станах Ctrl (рис. 4 A та B). SREBP є основними факторами лейцинової застібки-спіралі-петлі-спіралі, які регулюють гомеостаз ліпідів та метаболізм (31, 32). Хоча SREBP мають функцію, що перекривається, SREBP1 переважно активує гени, що беруть участь у синтезі жирних кислот, тоді як SREBP2 активує гени, необхідні для біосинтезу холестерину.

Розподіл ацетилювання метаболічних ферментів та метаболізму ацетил-КоА. (A) Теплова карта, що ілюструє диференціально ацетильовані печінкові білки при ZT4 (n = 4 на групу) шляхом гострого або хронічного подавання етанолу (EtOH) (P ⇓ –44). Показано, що дієтичні проблеми не тільки впливають на тканиноспецифічні метаболічні цикли, але й змінюють поведінковий та біоенергетичний ритми, що призводить до активації de novo альтернативних циркадних шляхів специфічно для тканин (20, 22, 45, 46).

Відомо, що ацетилювання білків змінює ферментативну активність (65). Наприклад, PYGL, обмежуючий швидкість фермент, що бере участь у катаболізмі глікогену, активується після хронічного вживання алкоголю шляхом деацетилювання (66) і може сприяти виснаженню запасів глікогену. З іншого боку, гіперацетилювання на Lys406 HADHA, ферменту бета-окислення, пов'язане зі зниженням ферментативної активності, можливо, сприяючи інгібуванню окислення жирних кислот у мітохондріях (67). Хоча точний вплив сайт-специфічного ацетилювання на активність або стабільність метаболічних ферментів ще слід з'ясувати, аналіз GO виявляє надмірне представлення ключових шляхів, що беруть участь в енергетичному обміні та патогенезі ALD. Наприклад, неправильна регуляція метаболізму печінкового метіоніну та окислення жирних кислот є результатом зловживання алкоголем та головним фактором, що сприяє розвитку АЛД (68, 69).

Дизайн нашого дослідження був зосереджений на тому, як алкоголь може впливати на циркадні функції, а не на паралельну алкогольну травму органу. Цей підхід дозволив мінімізувати вторинні події, такі як запалення та фіброз. Отже, ми надавали перевагу тваринним моделям з незначним підвищенням АЛТ та мінімальним стеатозом. Доза гострого введення алкоголю використовувала паралелі з попередніми дослідженнями (51), і хоча вона, як повідомляється, не спричиняла підвищення рівня АЛТ, була достатньою для збільшення концентрації алкоголю в крові (49, 70). Дійсно, ми спостерігали потужну індукцію експресії печінкових генів, що беруть участь у синтезі жирних кислот. З іншого боку, зміни експресії генів при гострому лікуванні EtOH, мабуть, виявляють реакцію на алкоголь, таким чином, імовірно, корелюючи з концентрацією алкоголю в крові. Проте важко відрізнити гостру реакцію на споживання EtOH від модуляції експресії циркадних генів. Таким чином, ми обгрунтували, що введення глюкози є відповідним контролем для моделі запою, щоб врахувати реагуючий ефект споживання калорій, виходячи з попередніх літератур (71 ⇓ –73).

На закінчення, різне споживання алкоголю диференційовано перепрограмує експресію печінкового циркадного гена та викликає розподіл ацетилювання субклітинного білка. Протилежний ефект гострого та хронічного живлення етанолом на добову регуляцію шляхів SREBP передбачає транскрипційну адаптацію до хронічного прийому етанолу, тоді як гостре вплив більше відображає реакцію на стрес. Підтримуючи це поняття, суттєвих змін у ацетилюванні білка в гострій печінці етанолу не спостерігалося. В цілому ці висновки сприяють подальшому розумінню диференціального механізму алкогольного ураження печінки і можуть призвести до ідентифікації цілодобових терапевтичних цілей та стратегій.

Методи

Детальні експериментальні процедури описані в Додатку SI, Текст SI.

Тварини та дієти.

Самці мишей дикого типу C57BL/6J (лабораторія Джексона, 000664) були утримувані з вільним доступом їжі та води під час 12-годинного світлового/12-годинного темного циклу. Перед початком дослідження годування етанолом мишей підтримували регулярну дієту чау (дієта 2020X Теклад Глобальна екструдована гризуна). Всі експерименти проводились відповідно до керівних принципів Комітету з догляду та використання тварин у Каліфорнійському університеті, Ірвін.

Гостре годування етанолом.

Самців мишей дикого типу C57BL/6J у віці від 12 до 24 тижнів випадковим чином розподіляли на групу етанолу та контрольну групу; 3,5 г/кг етанолу або ізокалорійної дози декстрози (7,2 г/кг) доставляли мишам перорально через ZT0. Тканини збирали в той же день, що і датчик на ZT1, 4, 8, 12, 16 та 20 (n = 5 на момент часу для кожної групи). Усі миші були розміщені індивідуально за 1 тиждень до збирання тканини.

Хронічне годування етанолом.

Самців мишей дикого типу C57BL/6J у віці 9 тижнів випадковим чином розподіляли на групу етанолу та контрольну групу. Контрольних мишей годували парами мишей, оброблених етанолом, контрольною рідкою дієтою без етанолу протягом 6 тижнів (Bioserv, Low Fat Lieber-DeCarli, F1340SP). Мишей, оброблених етанолом, годували контрольною рідкою дієтою протягом першого тижня, рідкою дієтою з етанолом поступово збільшували (Bioserv, Lieber-DeCarli з низьким вмістом жиру, F1341SP, 1% етанолу протягом 3 днів, 2% протягом 2 днів, 3,3% для 2 г) з мальтозою декстрином (Bioserv, 3653) протягом другого тижня та рідкою дієтою, що містить 5% етанолу, протягом наступних 4 тижнів. Тканини збирали на ZT0, ZT4, ZT8, ZT12, ZT16 і ZT20 (n = 4-6 на групу для кожного часового моменту).

Екстракція РНК та кількісний аналіз ПЛР у реальному часі.

Заморожені тканини печінки гомогенізували в реагенті TRIzol (Invitrogen). Загальну РНК виділяли осадженням ізопропанолом та етанолом; 1 мкг РНК реверсували транскрипцію в кДНК за допомогою набору синтезу комплементарної ДНК (кДНК) iScript (Bio-Rad Laboratories, 1708840), згідно з протоколом виробника.

кДНК використовували для кількісної ПЛР у реальному часі, використовуючи SsoAdvanced SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, 1725270). Експресія гена нормалізувалася до 18S рибосомної РНК. Послідовності праймерів, що використовуються для аналізу експресії генів, перелічені в наборі даних S7.

Наявність даних.

Дані про РНК-послідовності, про які повідомляється в цій роботі, доступні в Онібусі експресії генів. Номер приєднання - GSE132103.