ПРИКЛАД 1

Вплив олігоуронатів на властивості матригелю

Використовували Matrigel (BD Biosciences), отриманий від виробника. Досліджуваний G-блок (dp 10, вугільний фільтр) розчиняли при 10 мг/мл у фізіологічному розчині (150 мМ NaCl). Розчин G-блоку та фізіологічний розчин охолоджували на льоду, а стійки та наконечники піпеток Епендорфа - охолоджували. Матригель (4 × Епендорф, що містить 100 мкл) розморожували на льоду.

В якості контролю 100 мкл фізіологічного розчину додавали до кожного з 2 матригелів Епендорфів і піпетками вгору-вниз для досягнення повного перемішування. Вміст 2 пробірок перемішують і зберігають на льоду.

Для тестування G-блоку, 100 мкл розчину G-блоку додавали до кожного з 2 Matrigel Ependorfs і піпетували вгору та вниз для досягнення повного перемішування. Вміст 2 пробірок перемішували і зберігали на льоду.

300 мкл контрольного або досліджуваного розчину Матригеля наносили на пластини реометра при 10 ° C (з використанням геометрії C 40/1) для реологічного вимірювача. Комплексний модуль (G * в Па) вимірювали під час розгортки температури від 10-37 ° C ., ½ ° хвилини -1. G * є показником механічних властивостей випробовуваного матеріалу. Результати показані на фіг. 1.

Експеримент повторювали, включаючи інші олігоуронати: контроль (як зазначено вище), G-блок10 (Dp 10, 94% G: 5 мг/мл), G-блок20 (Dp 20, 90% G; 5 мг/миль), M- блоку (Dp 20, 100% M; 5 мг/мл) та олігомеру галактуроната (не повністю проаналізовано, але, як вважають, має Dp в діапазоні 10-20 та більше 80% галактуроната (GaIU); 5 мг/мл). Результати показані на фіг. 2.

В експерименті досліджували лише кінетику гелеутворення, а не рівноважні властивості. Тим не менше, з цих рисунків видно, що олігоуронати, особливо альгінатні олігомери, і особливо олігомери G-блоку (олігогулуронати) впливали на реологію препарату ECM матригелю і, зокрема, ефективні у зменшенні G *. Це чітко вказує на те, що на структуру впливає (порушується), і тверда поведінка ECM знижується. Іншими словами, олігоруронати зменшують гелеутворення або гелеподібну поведінку ECM.

Вплив блокування G як окремо, так і в поєднанні з гемцитабіном на моделі ксенотрансплантату пухлини підшлункової залози людини Capan-2

Метою цього дослідження була оцінка протипухлинної активності G-Block як підсилювача в комбінації з гемцитабіном на моделі ксенотрансплантата пухлини підшлункової залози людини Capan-2. Гемцитабін дозували на такому рівні, який не був би лікувальним і дозволяв довести оцінку концепції в цій моделі. Ефективність оцінювали шляхом порівняння ваги пухлини оброблених груп з контрольною групою-носієм на 11 та 74 день та між комбінованими групами та їх відповідними окремими агентами на 11 та 74 день.

Матеріали та методи

G-Block (Lot #PolyG 230712-Dp10, 95% G) отримували у вигляді білого гігроскопічного аморфного порошку від NTNU Technology Transfer AS (Тронхейм, Норвегія) і зберігали висушеним при кімнатній температурі до використання. G-блок NTNU розчиняли у воді MilliQ до концентрації 70 мг/мл для використання в якості основного розчину. Цей розчин використовували для доставки дози приблизно 560 мг/кг у фіксованій дозі 200 мкл. Потім розчин 70 мг/мл розбавляли 0,9% 150 мМ NaCl (B. Braun Medical; Irvine, Каліфорнія), щоб доставити дози приблизно 200 мг/кг, 75 мг/кг, 25 мг/кг та 5 мг/кг у фіксованому обсязі дози 200 мкл. Всі розрахунки дозування передбачають 25 г тварини. Вихідний розчин G-Block 70 мг/мл NTNU був сформульований на початку дослідження і використаний для розведення перед кожною дозою, стерильно відфільтрований та зберігався при 4 ° C між дозами. Вся невикористана дозована суміш була належним чином утилізована при TD2 після закінчення дослідження.

Гемцитабін (лот № A892259C) отримували у вигляді розчину від Eli Lilly and Co. (Індіанаполіс, штат Індіана) і зберігали при кімнатній температурі до використання. Гемцитабін розводили у фізіологічному розчині (B. Braun Medical; Irvine, Каліфорнія) до концентрації 0,5 мг/мл, щоб доставити дозу 5,0 мг/кг в обсязі дози 10 мл/кг. Гемцитабін формулювали свіжим перед кожною дозою. Вся невикористана дозована суміш була належним чином утилізована при TD2 після кожної дози.

Контроль транспортного засобу дозували розчином 0,9% 150 мМ NaCl при обсязі дози 10 мл/кг. Контроль транспортного засобу зберігали при кімнатній температурі.

Клітинну лінію ксенотрансплантата пухлини підшлункової залози людини Capan-2 отримували від ATCC (Manassas, VA). Культури підтримувались у середовищі МакКоя 5А (Hyclone, Logan, Utah), доповненому 10% плодовою бичачою сироваткою (Omega Scientific; Tarzana, Каліфорнія), і вміщувались в атмосфері 5% CO2. Культури розширювали в колбах з тканинними культурами при співвідношенні 1: 5, доки не було зібрано достатню кількість клітин.

Самки Athymic Nude мишей (Hsd: Athymic Nude-Foxn1 nu) постачав Harlan (Germantown, NY). Мишей приймали у віці 4 тижнів. Усі миші були акліматизовані перед обробкою. Мишей утримували в мікроізоляторних клітинах (Lab Products, Сіфорд, штат Делавер) і утримували у специфічних умовах, вільних від патогенів. Мишей годували лабораторним раціоном для тварин лабораторних тварин Tekland Global Diet® 2920 × (Харлан, штат Індіанаполіс, штат Індіана), і вода у автоклаві була вільно доступна. Всі процедури проводились відповідно до інституційних керівних принципів Комітету з питань догляду та використання тварин TGen Drug Development (Протокол № 13046).

Самкам мишей інокулювали підшкірно в правий фланг 0,1 мл 50% суміші RPMI/50% Matrigel ™ (BD Biosciences, Бедфорд, Массачусетс), що містить суспензію клітин пухлини Capan-2 (приблизно 5,0 × 106 клітин/миша ). Через сім днів після щеплення пухлини вимірювали за допомогою штангенциркулів та розраховували вагу пухлини за допомогою програмного забезпечення для управління дослідженнями на тваринах, керівник дослідження V.2.1.1 (Журнал дослідження) 1. Вісімдесят мишей з розмірами пухлини 101-194 мг були рандомізовані у вісім груп по десять мишей, кожна шляхом випадкового зрівноваження із середнім значенням приблизно 140 мг, за допомогою директора дослідження (день 1). Масу тіла реєстрували, коли мишей рандомізували, і потім їх брали двічі на тиждень разом із вимірами пухлини. Дозування проводили, як описано нижче в таблиці 1.

Усі групи були припинені на 74-й день. Мишей забивали до кінця дослідження, якщо вага пухлини перевищував 1500 мг. Після розтину пухлини вирізали у всіх тварин у всіх групах та розподіляли навпіл, поміщали у флакони з формаліном (Azer Scientific/VWR; Franklin Lakes, NJ), а потім фіксували протягом приблизно 24 годин перед переведенням на етанол. Тканини, закріплені формаліном, вбудовували в парафін, обробляли та фарбували Н & Е.

Всі групи лікування демонстрували збільшення маси тіла після перших кількох днів дослідження, що вказувало на те, що схема лікування добре переносилась. У деяких мишей відзначався незначний некроз пухлини. У однієї миші (група 2 миші 10) були нетипові клінічні спостереження за участю дискоїдних папул і маси на шкірі. Це спостереження не було визначено як пов’язане з лікуванням.

Результати зведені на фіг. 3 (А і В) та 4. Як показано на малюнках, напрочуд, оскільки G-блок одного агента призводив до зниження середньої ваги пухлини порівняно з контролем носія в кінці фази дозування. Всі комбіновані методи лікування G-блоком та гемцитабіном призвели до значного зменшення середньої маси пухлини порівняно з контролем носія в кінці фази дозування. Зниження середньої ваги пухлини можна спостерігати порівняно з окремими препаратами, зокрема, лише гемцитабіном.

Далі йдеться про статистичний аналіз ваги пухлини в дослідженні, про яке повідомляється в Прикладі 2. Це було доклінічне дослідження, в якому 10 мишей кожному було призначено вісім різних процедур за допомогою Vehicle (плацебо), G-Block 560 мг (енхансер), гемцитабіну 5 мг (онкологічний препарат) або комбінація гемцитабіну 5 мг з G-Block 5 мг, 25 мг, 75 мг, 200 мг або 560 мг. Вагу пухлини та масу тіла оцінювали 1-й день, а потім двічі на тиждень до останньої оцінки 74-го дня.

Вага пухлини - аналіз за днями

Аналіз AUC

Щоб отримати комбінований показник з часом, розраховували площу під кривою (AUC) для маси пухлини. Різні AUC розраховували протягом часових інтервалів 0-60 днів, 0-50 днів, 0-39 днів та 0-29 днів. Далі значення виражали як середню масу пухлини (Eav) через інтервали, діливши AUC на довжину інтервалу.

У таблиці 3 узагальнено результати базального аналізу ANOVA для кожного обчисленого параметра Eav. Статистично значущі ефекти проти транспортного засобу можуть бути продемонстровані для комбінацій (усі дози G-блоку) для всіх інтервалів до 60 днів, для гемцитабіну 5 мг для інтервалів до 50 днів та для G-Block для інтервалів до 39 днів. Як було видно при аналізі окремих днів, залишкове стандартне відхилення збільшується із збільшенням тривалості включеного інтервалу дня.

З часом вага пухлини збільшується, а також залишкова мінливість у моделях ANOVA. У таблиці 4 узагальнено результати відповідних моделей ANOVA на основі даних про вагу зареєстрованої пухлини, намагаючись стабілізувати дисперсію. Ці мультиплікативні моделі дають геометричні значення, оскільки оцінки та відмінності між групами лікування будуть виражатися як співвідношення таких геометричних засобів. Розрахункові співвідношення до транспортного засобу з 95% довірчими інтервалами проілюстровано на фіг. 8. Варіабельність, виражена як CV, все ще демонструє тенденцію до зростання, тому трансформація (арифметика журналів) не змогла її повністю стабілізувати. Що стосується статистично значущих ефектів (у порівнянні з Vehicle), результати дуже схожі на відповідні результати аддитивного аналізу.

Модельний підхід

Вивчення кривих середнього значення на фіг. 6 наближення з експоненціальними функціями, здається, добре підходить для даних середнього значення. Таким чином модель,

при цьому C був постійним (загальна вихідна вага пухлини), при швидкості росту пухлини для лікування i і t час дослідження (номер дня -1), відповідав даним. Для моделювання використовувались лише дані до 60 днів.

Отримані експоненціальні криві показані на фіг. 9 (чорні криві) разом з окремими кривими (тонкі червоні криві) та спостережувані криві середнього значення (сині криві). Для всіх активних процедур два типи кривих дуже схожі. Однак лікування автомобілем демонструє певні розбіжності, оскільки вага пухлини в середньому тут зростає більш ніж експоненціально спочатку, а потім сповільнюється. Це зумовлено трьома мишами з дуже швидким зростанням пухлини, як це показано на фіг. 9. З іншого боку, у деяких мишей, яким дано Vehicle, майже не спостерігається збільшення ваги пухлини взагалі, тому експоненціальні прирости відповідають прийнятному для представлення середньої поведінки в групі.

Фіг. 10 показує 8 встановлених експоненціальних кривих. Завдяки їх конструкції, ставки описують відмінності між процедурами, і в результаті різниці з часом одноманітно збільшуватимуться. Різниця в показниках між активними обробками та засобами транспортного засобу наведена в таблиці 5. Ставки всіх активних обробок мали статистично значно менший показник, ніж показник транспортного засобу. Таблиця 6 аналогічно показує різницю в показниках між активними методами лікування. Ставки були статистично достовірно меншими для всіх комбінацій G-Block та Gemcitabine порівняно з G-Block 560 mg та Gemcitabine 5 mg при застосуванні у вигляді монотерапії.

ТАБЛИЦЯ 5

Розрахункові різниці в порівнянні з транспортними засобами в темпах зростання
Контраст	Оцініть	95% C.I.	р-значення

G-Block 560 проти автомобіля	−0,0027	(−0,0046-−0,0007)	0,007
Гемцитабін 5 проти автомобіля	−0,0042	(−0.0062-−0.0022)

ТАБЛИЦЯ 6

Розрахункові відмінності між активними методами лікування у швидкості росту
Контраст	Оцініть	95% C.I.	р-значення

Гемцитабін 5 проти G-B 560	−0,0015	(-0,0037-0,0006)	0,166
G-B 5 + Самоцвіт. 5 проти G-B 560	−0,0061	(−0.0085-−0.0037)

Подальше вивчення впливу G-блоку в поодинці на модель ксенотрансплантату пухлини підшлункової залози людини Capan-2

Метою цього експерименту було дослідити реакцію на дозу та порівняти різні режими дозування. Матеріали та методи були такими, як описано в Прикладі 2, лише щодо G-блоків. Були протестовані дві різні схеми дозування G-Block. Перший, Q3x4, передбачав ін’єкцію G-Block кожні третій день із загальною кількістю чотирьох ін’єкцій, тобто, як це було зроблено в Прикладі 2. У другому режимі, Q3x10, ін’єкції G-Block робили кожен третій день, загалом десять ін’єкцій. Результати наведені на фіг. 11. У кожному експерименті 5 груп тварин (n = 10) вводили i.v. вводиться з носієм або G-блоком у трьох концентраціях, що відповідає дозам 0,5 мг/кг маси тіла, 25 мг/кг маси тіла або 560 мг/кг мас.

Вплив G-блоку на структуру ECM

Пухлини з Прикладу 2 аналізували за допомогою гістологічного аналізу після закінчення дослідження. Після розтину пухлини вирізали у всіх тварин у всіх групах та розподіляли навпіл, поміщали у флакони з формаліном (Azer Scientific/VWR; Franklin Lakes, NJ), а потім фіксували протягом приблизно 24 годин перед переведенням на етанол. Тканини, закріплені формаліном, вбудовували в парафін, обробляли та фарбували Н & Е. Результати гістології на фіг. 12 показують, що тварини, оброблені G-блоками, демонстрували менш щільний позаклітинний матрикс, що продемонстровано більшим відсотком білих ділянок у забруднених еозином областях.

Оцінка протипухлинної активності G-блоку як окремого агента та у комбінації з герцептином у моделі ксенотрансплантата пухлини яєчників людини SK-OV-3

Метою цього дослідження є оцінка протипухлинної активності G-Block як підсилювача в комбінації з герцептином у моделі ксенотрансплантата пухлини яєчників людини SK-OV-3.

G-Block (Lot #PolyG 230712- (Dp10, 95% G)) у вигляді білого гігроскопічного аморфного порошку постачається від NTNU Technology Transfer AS (Тронхейм, Норвегія) і зберігається висушеним при кімнатній температурі до використання. G-блок NTNU розчиняють у воді MilliQ до концентрації 70 мг/мл, що використовується як основний розчин. Цей розчин використовується для доставки дози приблизно 25 г/кг маси тіла у фіксованій дозі 60 мкл. Розчин 70 мг/мл розводять у 0,9% 150 мМ NaCl, щоб отримати інші дозуючі розчини по 25 мг/кг або 0,5 мг/кг у фіксованому обсязі дози 60 мкл. Всі розрахунки дозування передбачають 25 г тварини. Вихідний розчин G-Block 70 мг/мл NTNU формують на початку дослідження і використовують для розведення перед кожною дозою, стерильно фільтрують і зберігають при 4 ° C між дозами. Уся невикористана дозована суміш належним чином утилізується при TD2 після закінчення дослідження.

Трастузумаб (Герцептин) зберігається при кімнатній температурі до використання. Трастузумаб вводять у дозі 10 мг/кг в обсязі 10 мл/кг.

Контроль за транспортним засобом дозують розчином 0,9% 150 мМ NaCl при фіксованому обсязі дози 60 мкл. Контроль автомобіля зберігається при кімнатній температурі.

Ксенотрансплантат клітинної лінії пухлини яєчників людини SK-OV-3 отриманий від ATCC (Manassas, VA). Культури містяться в середовищі, що містить 10% плодової бичачої сироватки, і містяться в 5% атмосфері CO2. Культури розширювали в колбах з культурами тканин, поки не було зібрано достатню кількість клітин.

Жіночих атимічних оголених мишей постачає Harlan (Germantown, NY). Мишей приймають у віці від 5 до 8 тижнів. Мишей утримують у специфічних умовах, вільних від патогенів. Мишей годують лабораторною твариною Tekland Global Diet® 2920 × опроміненою лабораторною дієтою для тварин (Харлан, Індіанаполіс, Індіана), а вода в автоклаві знаходиться у вільному доступі.

SK-OV-3 Модель ксенотрансплантата пухлини яєчника людини

Самкам мишей інокулюють підшкірно в правий фланг 0,1 мл 50% середовища/50% Matrigel ™ (BD Biosciences, Бедфорд, Массачусетс), що містить суспензію клітин пухлини SK-OB-3 (приблизно 5,0 × 106 клітин/миша).

Лікування розпочинають з 1-го дня, згідно з таблицею 7 нижче. Об’єм пухлини та вага тіла вимірюють двічі на тиждень. Дозування проводиться, як описано нижче в таблиці 7 нижче.

Мишей жертвують перед закінченням дослідження, якщо об'єм пухлини перевищує 3000 мм 3. Після розтину пухлини вирізують у всіх тварин у всіх групах і ділять навпіл, поміщають у флакони з формаліном (Azer Scientific/VWR; Franklin Lakes, NJ) і фіксують протягом приблизно 24 годин перед переведенням на етанол. Тканини, закріплені формаліном, вкладають у парафін, обробляють та фарбують H & E.

Виконуються t-тест студента та обчислення% T/C. Для оцінки толерантності дози терапії створюються графіки зростання та відсотки зміни ваги миші.

Інфільтрація лімфоцитів пухлинною тканиною

Зразки пухлинної тканини, отримані в Прикладі 2, видаляли з мишей посмертно, вкладали парафін і готували до світлової мікроскопії з фарбуванням H&E.

Спостерігались відмінності у спостереженні лімфоцитів у зрізах тканин від мишей у контрольних групах та групах, які отримували G-блок (див. ФІГ. 13А та В). Миші, яким проводили лікування G-блоком, мали більший ступінь інфільтрації лімфоцитів у тканині пухлини порівняно з тканиною пухлини мишей контрольних груп, які не отримували лікування G-блоком. Показ скупчень інфільтруючих лімфоцитів (червоні стрілки). Миші - це голі миші, які не мають Т-лімфоцитів (Т-клітини-вбивці), але мають природні клітини-кілери (NK-клітини).

Позаклітинні матричні гелі готували в холодному вигляді з розмороженого Matrigel (BD Biosciences) при 75% отриманої концентрації, що містить 2 мкг/мл ALEXA488IgG (коза проти людини, технології Life) і 5 мл/мл G-блоку (DPn 12, 93% G) або іонна сила відповідно до контролю сольового розчину). 200 мкл зразків піпетували в камери склопакета, герметично закривали і нагрівали при 37 ° С протягом 30 хвилин для індукування гелеутворення. Лазерне світло високої інтенсивності (488 ліній аргонового лазера) використовувалося для відбілювання флуорофора, міченого IgG, в цікавій області та відновлення флуоресценції в цій області (в результаті невідбіленого міченого IgG, дифундуючого в область інтересу ззовні відбілювач).