Умови екстракції екстрактів пелюсток Rosa gallica з протистарінням шкіри

Unн Джу Шін

1 Традиційний дослідницький центр харчування, Корейський інститут харчових досліджень, Ванджу-гун, Єоллабук-до 55365 Республіка Корея

Ах-баран Хань

1 Традиційний центр харчових досліджень, Корейський інститут харчових досліджень, Ванджу-гун, Єоллабук-до 55365 Республіка Корея

Мен Хі Лі

Пісня Янг-Рана

Кванг Мін Лі

Те-Гю Нам

Помджу Лі

2 RAFIQ Cosmetics Co., Ltd., 14, Toegye-ro 48-gil, Jung-gu, Сеул, Республіка Корея

Сун-Янг Лі

3 Департамент сільськогосподарських біотехнологій, Сеульський національний університет, Сеул, 08826 Республіка Корея

Те-Гю Лім

Анотація

Протизапальна активність екстрактів пелюсток троянди була описана в нашому попередньому дослідженні. Оскільки запалення шкіри тісно пов’язане зі старінням шкіри, наше дослідження досліджувало вплив пелюсток Rosa gallica на такі дії, пов’язані зі старінням шкіри, як відбілювання шкіри та властивості проти зморшок. Кожен зразок готували шляхом екстракції з використанням різних співвідношень етанолу з метою оцінки оптимальних умов екстракції для промислового застосування. Водний 50% (об./Об.) Екстракт EtOH пелюстки R. gallica суттєво пригнічував активність тирозинази, вироблення меланіну та матрицю металопротеїнази-1, спричинену ультрафіолетовим випромінюванням, що є ознакою утворення зморшок. Крім того, водний 50% (об./Об.) Екстракт EtOH показав найвищий антиоксидантний ефект і мав найвищий вміст флавоноїдів, що відповідає повідомленим антивіковим ефектам. Загалом, наші висновки свідчать про те, що екстракти пелюсток R. gallica проявляють антивікові ефекти. Крім того, екстракція 50% EtOH, зокрема, була оптимальною для найвищого антивікового та антиоксидантного ефекту, а також для отримання найвищого вмісту флавоноїдів.

Вступ

Шкіра відіграє життєво важливу роль як захисний бар'єр від шкідливих факторів, пов'язаних зі спадковістю та генетикою, екологічними проблемами, гормональними змінами та обмінними процесами (Mukherjee et al., 2006). Серед них фактори навколишнього середовища, такі як вплив сонячного ультрафіолетового (УФ) випромінювання, виступають ключовими медіаторами, що сприяють передчасному старінню (Laga and Murphy, 2009). Основні симптоми старіння шкіри, яке виникає в результаті фотостаріння, включають глибокі зморшки, ненормальну пігментацію та еластичність (Farage et al., 2013; Wlaschek et al., 2001).

Пігментація є симптомом старіння, яке спричинене аномальним виробленням меланіну, що призводить до різних шкірних розладів, включаючи веснянки, мелазму, пігментні плями та інші синдроми гіперпігментації (D'Mello et al., 2016; Seo et al., 2003). У шляху меланогенезу тирозиназа має важливе значення як ферменти, що обмежують швидкість, що перетворює l-тирозин в l -DOPA і окислює l-DOPA, утворюючи DOPA-хінон (Akhtar et al., 2015). Отже, пригнічення тирозинази тісно пов’язане із синтезом меланіну. Більше того, утворення зморшок, спричинене втратою колагенових фібрил та еластази, є ще однією характеристикою фотостаріння. Матриця металопротеїнази-1 (MMP-1), що виділяється фібробластами шкіри людини, головним чином відповідає за деградацію колагену в процесі фотостаріння (Pandel et al., 2013). Пониження регуляції експресії MMP-1, яке інгібує деградацію колагену, може посилити функції, що покращують зморшки.

З вищевказаних причин використання інгібіторів тирозинази або інгібіторів ММП вважається перспективною стратегією для полегшення фотостаріння шкіри. Попередні дослідження показали, що ретинол, екстракт часнику (кофеїнова кислота та S-союзник цистеїну) та фітоцерамід, койєва кислота, арбутин та вітамін С можуть діяти як інгібітори старіння шкіри (Couteau and Coiffard, 2016; Kim et al., 2013) . Однак використання цієї речовини передбачає певні обмеження, такі як різні побічні ефекти, включаючи цитотоксичність, запах та забарвлення (Yamakoshi et al., 2003). Тому нинішні дослідження зосереджені на розробці більш безпечних природних компонентів, які забезпечують ефективний захист шкіри від фото.

Види рози, вирощені у всьому світі, вважаються хорошим джерелом дієтичних добавок. Екстракт пелюсток троянди (RPE), який містить такі елементи, як фенольна кислота, флавоноли та антоціани, на додаток до інших біологічних ролей виявляє багато корисних ефектів, таких як протизапальна активність шкіри (Bitis et al., 2017; Lee et al., 2018; Masek et al., 2017; Navarro-Gonzalez et al., 2015). Оскільки відомо, що ці властивості RPE пов’язані зі старінням шкіри, він був запропонований як потенційний кандидат на захист шкіри. Однак мало відомо про вплив RPE на старіння шкіри. Крім того, вода та етанол вважаються найкращими екстракційними розчинниками через різницю полярності та безпеку використання (Abarca-Vargas et al., 2016). Таким чином, зразки з різним співвідношенням води та етанолу (0, 10, 30, 50, 70, 90 та 100% етанолу RPE) готували екстракцією.

Метою цього дослідження було дослідити вплив RPE на відбілювання шкіри та поліпшення зморшок. Екстракти RPE з різними співвідношеннями екстракційних розчинників (0, 10, 30, 50, 70, 90 та 100% розчинники етанол/вода) були протестовані для визначення оптимального співвідношення розчинників для екстракції.

Матеріали та методи

Реагент

Пелюстки Rosa gallica були імпортовані з Туреччини через GN Bio (Кьонгі, Корея). Модифіковане середовище Орла (DMEM) Дульбекко, бичача сироватка плода (FBS), пеніцилін – стрептоміцин – неоміцин та 0,5% трипсину – ЕДТА були придбані у компанії GIBCO ® Invitrogen (Окленд, Нью-Йорк, США). Специфічні антитіла проти тирозинази та β-актину були придбані у компанії Santa Cruz Biotech (Санта Круз, Каліфорнія, США). Первинне антитіло до MMP-1 отримували з R&D systems ™. Всі інші хімічні речовини, включаючи альфа-меланоцитостимулюючий гормон (α-MSH), грибну тирозиназу та l-DOPA (l -3,4-дигідроксифенілаланін) були придбані у Sigma-Aldrich Co., LLC (Сент-Луїс, Міссурі, США ).

Підготовка зразка

Пелюстки троянд змішували зі 100 мл 0, 10, 30, 50, 70, 90 та 100% (об/об) EtOH (абсолютний етанол). Потім розчинні компоненти екстрагували у воді з температурою 80 ° C за допомогою зворотного холодильника. Екстракт фільтрували через фільтрувальний папір №2 (Whatman, Maidstone, England), концентрували у вакуумі і згодом розчиняли у дистильованій воді та сушили ліофілізацією для використання в якості зразків для тесту функціонального аналізу.

Культура клітин

Клітини меланоми B16F10 були придбані в Корейському банку клітинних ліній (Сеул, Корея). Клітини людського шкірного фібробласту (HDF) були отримані від доктора Цзінь Хо Чунга (Медичний коледж, Сеульський національний університет, Сеул, Корея). Обидві клітини культивували в DMEM з доповненням 10% фетальної бичачої сироватки (об/об) і 1% (об/об) пеніциліну при 37 ° C та 5% CO2.

Життєздатність клітин

Життєздатність клітин вимірювали за допомогою аналізу MTS [3- (4,5-диметилтіазол-2-іл) -5- (3-карбоксиметоксифеніл) -2- (4-сульфофеніл) -2Н-тетразолію]. Клітини висівали на 96-лункові планшети і вирощували до злиття. Потім клітини голодували без сироватки DMEM протягом ночі і обробляли зразками при зазначених концентраціях протягом 24 годин. Після впливу зразків 20 мкл розчину МТС дозволяли реагувати з клітинами протягом 1 години. Поглинання вимірювали за допомогою зчитувача мікропланшетів (Sunrise-Basic Tecan, Tecan Austria GmbH Grödig, Австрія) при 570 нм.

Активність грибів тирозинази in vitro

Аналіз in vitro на тирозиназу проводили згідно з методами, описаними раніше (Kim et al., 2015). Коротше кажучи, 40 мкл кожної проби додавали в буфер для аналізу (20 мкл 0,1 М фосфату калію) з подальшою інкубацією протягом 30 хв з 20 мкл грибної тирозинази (0,02 мг/мл). Потім до кожної суміші додавали 40 мкл субстрату (1 -DOPA). Реакції давали протікати при кімнатній температурі протягом 15 хв, перш ніж утворення допахрому аналізували, вимірюючи поглинання при 475 нм за допомогою мікропланшетного зчитувача (Infinite ® 2000 PRO, Tecan, Швейцарія).

Оцінка вироблення меланіну

Аналіз на виробництво меланіну проводили згідно з раніше описаним протоколом (Friedmann and Gilchrest, 1987; Gordon et al., 1989). Клітини B16F10 (8 × 10 3 клітин) висівали на 6-лункові планшети з 2 мл культурального середовища. Через 24 год зразки попередньо обробляли клітинами протягом 1 год, після чого α-MSH (100 нМ) піддавали дії клітин. Клітини збирали через 72 год, а вироблення меланіну вимірювали за допомогою зчитувача мікропланшетів (Infinite ® 2000 PRO, Tecan, Швейцарія) при 495 нм.

Вестерн-блот

Зразки білка отримували з клітин, використовуючи 1 × буфер для лізису клітин (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Концентрацію білка оцінювали за допомогою набору для аналізу білка Pierce ™ BCA (Thermo Fisher Scientific, Сан-Хосе, Каліфорнія, США). Зразки білка завантажували у 10% SDS-поліакриламідний гель (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія, США) для електрофорезу, а потім переносили на мембрану Immobilon P (Millipore, Billerica, MA, USA). Мембрану PVDF блокували 5% знежиреним молоком протягом 1 год, а мембрану обробляли специфічним первинним антитілом протягом ночі при 4 ° С. Білкові смуги виявляли за допомогою набору для виявлення хемілюмінесценції (GE Healthcare, NJ, США) після гібридизації з кон'югованим HRP вторинним антитілом (Cell Signaling).

Аналіз знищення радикалів DPPH

Активність прибирання радикалів DPPH вимірювали наступним чином; 0,2 мл кожного екстракту додавали до 3 мл етанолу, до якого додавали 0,8 мл 400 мкМ DPPH, розчиненого в етанолі. Цю суміш вирвали протягом 10 с і витримували при кімнатній температурі протягом 10 хв, а поглинання вимірювали при 517 нм (Wang et al., 1999). Активність поглинання радикалів DPPH виражалася як відсоток поглинання групи, до якої не додавали DPPH. Усі експерименти повторювали мінімум 3 рази.

Загальний вміст флавоноїдів

Загальний вміст флавоноїдів у екстрактах вимірювали методом хлориду алюмінію (Jia et al., 1999), який модифікували за допомогою катехіну. До 100 мкл екстракту додавали 500 мкл дистильованої води та 30 мкл NaNO2, після чого через 6 хв додавали 60 мкл AlCl3. Через 5 хв додавали 200 мкл 1 М NaOH і доводили до 1 мл дистильованої води. Розчин добре перемішували і центрифугували при 15928 г при 4 ° С протягом 5 хв. Після центрифугування було отримано 200 мкл надосадової рідини та виміряно поглинання за допомогою зчитувача мікропланшетів (Infinite ® 2000 PRO; Tecan, Швейцарія) при 510 нм.

Статистичний аналіз

Експерименти проводились у трьох примірниках, і дані виражали як середнє значення ± стандартне відхилення (SD). T-критерії Стьюдента використовувались для окремих статистичних порівнянь. Статистичну значимість встановлювали на рівні (#) = p 1 A). Цікаво, що колір кожного екстракту змінювався залежно від візуального спостереження (рис. 1 Б). Колір екстрактів EtOH, 90% або вище, був чітким, тоді як 50% (об/об) екстракту EtOH виявився найбільш червонуватим. Результат колориметра показав значення * для почервоніння для 50% EtOH, яке показало найвищий рівень серед екстрактів (рис. 1 С).

Добування пелюсток Rosa gallica. Зразок приготування екстрактів EtOH з пелюсток Rosa gallica (A). Зображення різних екстрактів EtOH з пелюсток Rosa gallica (B). Вимірювання значення * вимірювача різниці кольорів (C.). Дані представляють 3 незалежні експерименти, які дали подібні результати. Знак (**) вказує на значущу (р 2 А). Крім того, 30% та 50% екстракти EtOH виявляли сильніші інгібуючі ефекти, ніж аскорбінова кислота. Аскорбінова кислота була описана як засіб для відбілювання шкіри в попередній літературі (Chang, 2009). Для оцінки активності відбілювання шкіри екстрактів на клітинній моделі оцінювали вироблення меланіну в клітинах меланоми B16F10 після обробки кожним екстрактом. Порція α-MSH у кількості 100 нМ збільшувала вироблення меланіну, а кожен екстракт пелюстки троянди пригнічував вироблення меланіну (рис. 2 Б). Крім того, 30% та 50% екстрактів EtOH показали найсильніший інгібуючий ефект на активність тирозинази та вироблення меланіну in vitro відповідно. За подібних умов досліджували вплив кожного з екстрактів на експресію тирозинази. Крім того, α-MSH збільшив експресію тирозинази та на 100 мкг/мл кожен з екстрактів послабив експресію тирозинази (рис. 2 С). Обробка екстрактами при 100 мкг/мл не спричиняла цитотоксичності клітин у клітинах меланоми B16F10 (рис. 2 D). Таким чином, інгібування меланіну RPE пояснюється подвійним з’єднанням активності тирозинази та вираженням відсутності цитотоксичності.

Припускається, що темно-червоний колір 50% -ного розчинника EtOH пелюстків троянд пов'язаний з антоціаніном, флавоноїдом (рис. 1). Цей результат підтверджує результати попереднього дослідження (Oancea et al., 2012). Згідно з попереднім дослідженням, антоціани в чорниці (Vaccinium orymbosum L.) найкраще екстрагували в 50% розчиннику EtOH, ніж у будь-якому іншому розчиннику, включаючи 60%, 70% та 80% EtOH (Oancea et al., 2012). Природно, що антоціани трапляються у вигляді глікозидів. Таким чином, ми припустили, що полярність антоціанів могла бути надана 50% розчинником EtOH. Сильна антиоксидантна активність антоціанів добре демонструється в різних модельних системах (Kalt et al., 2003; Rice-Evans et al., 1995). Оскільки 50% екстракту пелюсток троянди EtOH мали найвищий вміст антоціану, антиоксидантна активність 50% екстракту EtOH була найсильнішою серед екстрактів 50 мкг/мл.

Таким чином, наше дослідження продемонструвало потенціал RPE як інгредієнта проти старіння шкіри. З метою промислового застосування оптимізація умов видобутку є важливою для зменшення виробничих витрат. Поточне дослідження досліджувало розчинники, найбільш придатні для екстракції пелюсток троянди, з посиланням на активність проти старіння шкіри. Флавоноїди у пелюстках троянд найкраще екстрагували 50% -ним розчинником EtOH. Цей екстракт виявляв найсильнішу антиоксидантну активність, а також активність проти старіння шкіри, таку як відбілювання шкіри та придушення зморшок. Для перевірки його придатності для промислового застосування можуть знадобитися клінічні дослідження та аналізи стабільності.

Подяка

Це дослідження було підтримано Головною дослідницькою програмою (E0183112-02) Корейського науково-дослідного харчового інституту (KFRI), що фінансується Міністерством науки, ІКТ та планування майбутнього та Корейським інститутом планування та оцінки технологій у харчовій, сільській, лісовій та Рибальство (IPET) за допомогою Програми розвитку харчових технологій із високою доданою вартістю, що фінансується Міністерством сільського господарства, продовольства та сільських справ (MAFRA) (118060-03-2-HD020).

Дотримання етичних норм

Серед авторів немає конфлікту інтересів.

Виноски

Примітка видавця

Springer Nature залишається нейтральним щодо юрисдикційних вимог в опублікованих картах та інституційних приналежностей.