Вживання дієти з високим вмістом цукру, фізична активність та перехресна мікробіота в кишечнику: наслідки ожиріння у щурів

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилія

Програма де Pós ‐ graduação em Ciências Farmacêuticas, Escola de Farmácia, Федеральний університет Оуру-Прету, Ору-Прету, Бразилія

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилія

Програма де Pós ‐ graduação em Ciências Farmacêuticas, Escola de Farmácia, Федеральний університет Оуру-Прету, Ору-Прету, Бразилія

Листування

Рената Герра-де-Са, Інститут громадських вишукувачів біології, Департамент біологічних наук, Федеральний університет Ору-Прету, Ору-Прету, штат Мічиган, Бразилія.

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилія

Програма де Pós ‐ graduação em Ciências Farmacêuticas, Escola de Farmácia, Федеральний університет Оуру-Прету, Ору-Прету, Бразилія

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Бразилія

Програма де Pós ‐ graduação em Ciências Farmacêuticas, Escola de Farmácia, Федеральний університет Оуру-Прету, Ору-Прету, Бразилія

Листування

Анотація

1. ВСТУП

Споживання простих вуглеводів, переважно продуктів переробки з високою дозою доданого цукру, значно зросло за останні десятиліття (Rippe & Angelopoulos, 2016; Yudkin, 1972). Збільшення споживання цукру на душу населення вказувалося в численних дослідженнях як одна з причин розвитку таких метаболічних захворювань, як ожиріння та діабет (Kelishadi, Mansourian, & Heidari-Beni, 2014; Malik, Schulze, & Hu, 2006 ). Насправді дослідження показують, що споживання дієт з високим вмістом цукру призводить до розвитку ожиріння та метаболічних розладів, характерних для метаболічного синдрому людини, незалежно від споживання калорій (Oliveira et al., 2020; Pinto et al., 2016; Queiroz та ін., 2014; Соуза та ін., 2018).

Про переваги фізичної активності повідомляється з 1950-х років, головним чином у зниженні рівня смертності від хронічних захворювань (Espeland et al., 2016). Фізичне тренування приносить величезну користь для здоров’я людини, і дослідження показують, що фізичні вправи у поєднанні з обмеженою дієтою з низьким споживанням калорій можуть бути ефективними для схуднення (Washburn et al., 2014). Це пояснюється головним чином потребою в енергії, яка спричиняє сильніше окислення жирних кислот, а також більшим виробленням гормонів, пов’язаних з метаболічним контролем (Washburn et al., 2014). Прагнучи зрозуміти вплив регулярних фізичних вправ на дієту з високим вмістом цукру, наша дослідницька група показала в попередньому дослідженні, що навчання плаванню на моделі щурів Wistar змогло значно зменшити індекс ожиріння у тварин через споживання цукру з високим вмістом цукру дієта (Queiroz et al., 2012).

На основі попередніх даних нашої дослідницької групи та нових висновків про вплив мікробіоти на здоров’я господаря, ми зосередились на оцінці того, чи може плавальне тренування з навантаженням змінити наслідки хронічної дієти з високим вмістом цукру, модулюючи кишечник мікробіоти і, як наслідок, поліпшення енергетичного метаболізму господаря.

2 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИЙ РОЗДІЛ

2.1 Тварини, дієта та фізична підготовка

У цьому дослідженні було використано 32 нещодавно відлучених (з 28 старими днями) самців щурів Wistar (56,93 ± 5,2 г). Усі експериментальні процедури виконувались відповідно до бразильських керівних принципів експериментів на тваринах Національної ради з контролю експериментів на тваринах (CONCEA) та затверджено Комітетом з етики у використанні тварин Федерального університету Оуро Прето (UFOP) (номер протоколу) 26/2016). Тварин утримували в колективних клітках в умовах контрольованого освітлення (цикл світла та темряви 12:12 год) та кімнатної температури 24 ± 2 ° C з вільним доступом до води та їжі.

Щурів Wistar випадковим чином розділили на чотири групи: сидяча стандартна дієта чау (SSD, n = 8), навчена стандартна дієта чау (TSD, n = 8), сидяча дієта з високим вмістом цукру (SHD, n = 8), а також навчена дієта з високим вмістом цукру (THD, n = 8). Тварин груп SSD та TSD годували стандартною чау-чау (Nuvilab CR1®, Коломбо, Бразилія), що складалася з 57,16% вуглеводів (з додаванням 0% цукру). Тварин груп SHD та THD годували раціоном з високим вмістом цукру, що складався з 66,86% вуглеводів (36,32% доданого цукру). Таблиця поживного складу дієт була раніше опублікована в літературі (Oliveira et al., 2020). Усі групи годувались відповідними дієтами протягом 15 тижнів.

Тренувальні групи (TSD та THD) регулярно проходили тренування з плавання. Протокол фізичної активності виконували у басейні (ширина 150 см × 100 см × 60 см), що містить попередньо нагріту воду при температурі 31ºC ± 2ºC. Адаптацію до водного середовища та навчання плаванню проводили перед регулярною фізичною підготовкою наступним чином: У перший тренувальний день тварини плавали протягом 15 хв, а в наступні дні його збільшували на 15 хв на день, досягаючи максимуму 60 хв четвертого дня адаптаційного тижня. На другому тижні тварини завершували сеанси плавання по 60 хв протягом п’яти днів. Після цього періоду, починаючи з третього тижня, тварини отримували 60-хвилинне плавання щодня із навантаженням 2% від ваги їх тіла протягом п’яти днів на тиждень. Вагові вантажі прикріплювали на хвости. Після кожного сеансу плавання тварин сушили, щоб уникнути зниження температури тіла. Цей експериментальний аналіз тривав загалом 15 тижнів.

2.2 Відбір проб та аналіз параметрів метаболізму

На 15-му експериментальному тижні тварин (п’ять тварин на групу) розміщували в метаболічній клітці протягом 24 годин. Зразки калу збирали і негайно зберігали в наднизькій морозильній камері при -80 ° C для подальшої екстракції та аналізу ДНК. Наприкінці випробувального періоду, через 24 години після завершення протоколу фізичної підготовки, тварин подавали на голодний стан і евтаназували вдиханням вуглекислого газу (100% газу вуглекислого газу при швидкості поступового заповнення 20% -30 % від об'єму камери за хвилину). Жирові прокладки (заочеревинний, епідидимальний та паховий) розсікали та зважували для оцінки жирового індексу, використовуючи таке рівняння: (Вага жирової подушки (г)/Вага тіла (г) × 100) (Taylor & Phillips, 1996). Зразки крові також збирали і центрифугували 800 об/хв протягом 15 хв. Потім у сироватці крові вимірювали наступних виробників біохімії: холестерин, креатинін, глюкозу, ліпопротеїди низької щільності (ЛПНЩ), ліпопротеїни високої щільності (ЛПВЩ), сечовина, тригліцериди та ліпопротеїни дуже низької щільності (ЛПНЩ). Всі біохімічні параметри вимірювали за допомогою наборів Bioclin/Quiabasa (Belo Horizonte, MG, Бразилія), згідно з протоколами виробника.

2.3 Аналіз мікробіоти калу

2.3.1 Екстракція калу ДНК

Кал витримували замороженим при -80 ° C до процесу екстракції. Аналіз вилучення ДНК проводили згідно з Міжнародними стандартами мікробіома людини (IHMS), що виділяє ДНК фекалій (http://www.microbiome-standards.org/). Однак адаптація цього протоколу була зроблена до етапу 16: хлороформ (1: 1) додавали в супернатанти, перемішували протягом 5 хв, а потім центрифугували при 12000 об/хв протягом 10 хв. Надосадову рідину збирали без проміжних забруднень шару. Після цього кроку всі наступні процедури виконувались точно так, як описано в протоколі IHMS. Кількісну оцінку ДНК проводили за допомогою флуорометра Qubit 3.0 (Thermofisher Scientific). Забруднення білками оцінювали за співвідношенням A260/A280 за допомогою нанодропа (Thermofisher Scientific), а цілісність ДНК - 0,6% електрофорез в агарозному гелі.

Секвенування та аналіз гена рибосомної РНК 16S

Склад мікробіома кишечника оцінювали за допомогою послідовності гена прокаріотичної 16S рибосомної РНК (рРНК) ДНК, витягнутої з калу. Область V4 гена 16S рРНК ампліфікували за допомогою праймера Foward 515 (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) та зворотного праймера 806 (TAATCTWTGGGVHCATCAGG) (Caporaso et al., 2011), дотримуючись вказівок виробника 16S RNA Illumina. Парна бібліотека була побудована з використанням бібліотеки ДНК Nextera ®, а високопродуктивне секвенування проводилось на Illumina MiSeq, комплект V2 500 Cycle (Illumina, Сан-Дієго, Каліфорнія, США).

2.4 Статистичний аналіз

Статистичний аналіз здійснювали за допомогою пакетного програмного забезпечення GraphPad Prism, версія 6.01 (GraphPad Software, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Всі аналізи, що використовували двосторонній тест ANOVA, слідували пост-хоку тесту Бонферроні, враховуючи стор‐Значення

3 РЕЗУЛЬТАТИ

3.1 Регулярні заняття плаванням скасовують обезогенний ефект, викликаний дієтою з високим вмістом цукру

У таблиці 1 представлені результати біохімічного аналізу різних сироваткових метаболітів експериментальних груп. Згідно з результатами, рівень тригліцеридів та ЛПНЩ в сироватці крові суттєво впливав на дієту (стор ТАБЛИЦЯ 1. Біохімічні параметри щурів Wistar подали експериментальні групи: сидяча стандартна дієта чау (SSD), навчена стандартна дієта чау (TSD), сидяча дієта з високим вмістом цукру (SHD) та тренована дієта з високим вмістом цукру (THD) протягом 15 тижнів

Групи параметрів М ± SDстор‐Значення SSD TSD SHD THD Дієта Дієта Ефекти навчання Взаємодія ефекту

Холестерин мг/дл	83,0 ± 11,0	84,0 ± 16,0	75,0 ± 14,0	77,0 ± 21,0	> 0,99	> 0,99	> 0,99
Креатинін мг/дл	0,74 ± 0,18	0,64 ± 0,05	0,77 ± 0,05	0,88 ± 0,11	> 0,99	0,86	> 0,99
Глюкоза мг/дл	119,0 ± 15,0	122,0 ± 28,0	132,0 ± 11,0	126,0 ± 18,0	> 0,99	> 0,99	> 0,99
ЛПВЩ мг/дл	23,0 ± 2,5	26,0 ± 2,0	23,5 ± 3,0	26,0 ± 5,0	> 0,99	0,82	> 0,99
LDL мг/дл	40,0 ± 6,0	41,0 ± 14,0	25,0 ± 11,0	32,0 ± 17,0	0,15	> 0,99	> 0,99
Тригліцериди мг/дл	96,0 ± 33,0	83,0 ± 16,0	151,0 ± 42,0 a, c, a, c a Позначає значну різницю в порівнянні з групою SSD. c позначає значну різницю порівняно з групою TSD. N: 8 тварин на групу.	95,0 ± 28,0 b b позначає значну різницю в порівнянні з групою SHD.	0,99
ЛПНЩ мг/дл	19,0 ± 7,0	16,5 ± 3,0	30,0 ± 8,0 a, c, a, c a Позначає значну різницю в порівнянні з групою SSD. c позначає значну різницю порівняно з групою TSD. N: 8 тварин на групу.	19,0 ± 6,0 b b позначає значну різницю в порівнянні з групою SHD.	0,99
Сечовина мг/дл	56,0 ± 7,0	59,0 ± 17,0	48,0 ± 6,0	50,0 ± 19,0	0,75	> 0,99	> 0,99

Дані виражаються як середнє значення ± стандартне відхилення (М ± SD). Дані перевірені за допомогою двостороннього тесту ANOVA з корекцією після тесту Бонферроні. стор a Позначає значну різницю в порівнянні з групою SSD.
b позначає значну різницю в порівнянні з групою SHD.
c позначає значну різницю порівняно з групою TSD. N: 8 тварин на групу.

Дані біометричного профілю представлені в таблиці 2. Споживання дієти з високим вмістом цукру призвело до збільшення маси тіла тварин (стор ТАБЛИЦЯ 2. Біометричні параметри щурів Wistar подали експериментальні групи: сидяча стандартна дієта чау (SSD), навчена стандартна дієта чау (TSD), сидяча дієта з високим вмістом цукру (SHD) та тренована дієта з високим вмістом цукру (THD) протягом 15 тижнів

3.2 Аналіз мікробіома калу

Ефект дієти з високим вмістом цукру та регулярного тренування плавання у складі мікробіоти кишечника щурів визначали за допомогою секвенування 16S рРНК. Отримані послідовності були зіставлені в базі даних зелених генів. В середньому показання послідовності 16S рРНК для кожного зразка (

580 тис.) Були отримані за допомогою програми 16S Basespace Illumina. Як спостерігали на кривих розрідження (рис. 1а) (та їх тенденція досягати насиченого плато), отримані показники забезпечували достатню глибину послідовності для аналізу таксономічних ідентифікацій. Відсутність змін індексу різноманітності Шеннона вказує на однорідність видової оцінки калового мікробіома серед експериментальних груп (рис. 1b; стор = .86). Склад мікробіоти калу серед експериментальних груп на рівні філу та класу наведено на рисунку 1c, d відповідно. Бактероїди, фірмікути та, меншою мірою, актинобактерії, фібробактери та синергістети були найпоширенішим типом, виявленим в експериментальних групах цього дослідження (рис. 1д). На рівні класу найбільш поширеними були такі: Бактероїди, Флавобактерії, Сфінгобактерії, Цитофагія, Актинобактерії, Фібробактерії, Клостридії, Еризипелотрічі, Негатикути та Бацили (Рисунок 1е).

3.3 Дієта з високим вмістом цукру та регулярне навчання плаванню формують мікробіом на різних таксономічних рівнях

У цьому дослідженні було виявлено 59 видів, 59 класів, 114 порядків, 244 сім’ї та 610 рід. Тим не менше, лише декілька таксономічних рівнів були суттєво змінені. Значні зміни у відносному достатку різних таксономічних рівнів між експериментальними групами у дослідженні представлені на малюнках 2-6-2-6. На рівні типу (рис. 2) дієта з високим вмістом цукру зменшила кількість актинобактерій (стор

На рівні класу (рис. 3) на кількість фібробактерій впливала дієта (стор

4 ОБГОВОРЕННЯ

Це дослідження показало, що споживання дієти з високим вмістом цукру та регулярні тренування плавання викликали динамічні зміни мікробіоти калових мас щурів. Точніше, ми виявили, що ожиріння, спричинене споживанням дієти з високим вмістом цукру, глибоко модифікує склад мікробіоти кишечника, змінюючи рівень поширення таксонів, пов'язаних з розвитком таких патологій, як ожиріння. Однак дресирування змогло змінити обезогенний ефект, спричинений дієтою з високим вмістом цукру, і відновити рівень чисельності цих модифікованих таксонів до рівня, сумісного з тими тваринами, які отримували стандартну дієту чау. Навчання у поєднанні зі споживанням стандартної дієти чау також було корисним для мікробіоти кишечника, збільшуючи кількість бактерій, що мають пробіотичні ефекти. Однак такий ефект тренувань не спостерігався у тварин, які вживали дієту з високим вмістом цукру. Ці висновки вказують на те, що регулярні фізичні вправи за плаванням можуть позитивно впливати на мікробіоти кишечника щурів, відновлюючи змінені схеми внаслідок високого споживання цукру до нормального рівня. Однак сам тренінг не здатний викликати корисні адаптації мікробіоти для здоров'я господаря, порівняно з його асоціацією зі збалансованим харчуванням.

Тренінг зміг змінити обезогенний ефект, спричинений дієтою з високим вмістом цукру, така подія супроводжувалася зменшенням рівня чисельності таксономічних рівнів, які регулювались дієтою з високим вмістом цукру (Enterobacteriales order, Enterobacteriaceae та Helicobacteriaceae сім'ї та Ешерихії і Педіокок рід). Підтверджуючи наші висновки, інші автори спостерігали зменшення кількості бактерій, пов’язаних з типом протеобактерій, у щурів, які піддавались фізичній підготовці (гонки з високою інтенсивністю) (Liu et al., 2015; Petriz et al., 2014).

На закінчення, наші результати вказують на те, що хронічне споживання дієти з високим вмістом цукру призводить до розвитку ожиріння та динамічних змін мікробіоти калу в таксонах, пов’язаних з порушенням обміну речовин, і що регулярне тренування плавання ефективно призводить до скасування таких змін. Регулярні заняття плаванням, пов’язані зі збалансованим харчуванням, також викликали корисні адаптації мікробіоти. Однак тренінг сам по собі не в змозі підтримувати цей профіль, враховуючи споживання обезогенної дієти з високим вмістом цукру. Отже, форма мікробіоти кишечника може опосередковувати добре відомі корисні ефекти регулярних фізичних вправ, пов’язаних зі збалансованим харчуванням, на здоров’я господаря.

ПОДЯКИ

Це дослідження було підтримано Національним десервовим центром державної політики (CNPq; номер гранту 310733/2014‐6), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG; номер гранту CBB APQ 02772), Coordenação de Aperfei Pessoal de Nível Superior (CAPES; Фінансовий кодекс 001) та UFOP.

КОНФЛІКТ ІНТЕРЕСІВ

Усі автори не заявляють про конфлікт інтересів.