Q Exactive HF, настільний мас-спектрометр з попереднім фільтром, високоефективним квадруполем та аналізатором надвисоких полів *

Річард Олександр Шелтема

З кафедри протеоміки та передачі сигналів Інституту біохімії Макса Планка, Am Klopferspitz 18, D-82152 Martinsried, Німеччина;

Ян-Пітер Хаушильд

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Німеччина

Олівер Ланге

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Німеччина

Даніель Горнбург

З кафедри протеоміки та передачі сигналів Інституту біохімії Макса Планка, Am Klopferspitz 18, D-82152 Martinsried, Німеччина;

Едуард Денисов

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Німеччина

Євген Дамок

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Німеччина

Андреас Кюн

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Німеччина

Олександр Макаров

§Thermo Fisher Scientific (Bremen) GmbH, Hanna-Kunath-Strasse 11, 28199 Бремен, Німеччина

Маттіас Манн

З кафедри протеоміки та передачі сигналів Інституту біохімії Макса Планка, Am Klopferspitz 18, D-82152 Martinsried, Німеччина;

Пов’язані дані

Анотація

Наномасштабна рідинна хроматографія, поєднана в Інтернеті з мас-спектрометрією, є поточним методом вибору для аналізу складних пептидних сумішей. У стратегії топ-N-дробовика повне сканування, що забезпечує повний огляд ізотопних моделей, отриманих в результаті дії іонізованих пептидів, супроводжується скануванням N-фрагментації, проведеним на найбільш розповсюджених ще не послідовно розподілених ізотопних моделях, які в даний час видно у повному скануванні. Під час фрагментації мета полягає в чистому виділенні передбачуваного іона-пептиду-попередника, що сьогодні, як правило, здійснюється або лінійною пасткою іонів, або квадрупольним фільтром маси. Потім іони фрагментів вимірюються за допомогою аналізатора маси Orbitrap, аналізатора часу прольоту або, рідше, іонного циклотронного резонансу – перетворення Фур’є або лінійних або тривимірних іонних пасток.

Окрім контрольно-вимірювальних приладів MS, останні розробки в робочому процесі протеоміки включають перехід до автоматизованих онлайн-систем контролю якості (7, 8) та одноразові аналізи (9), які вимагають дуже високоефективної пептидної хроматографії (10, 11).

Тут ми описуємо досягнення, вбудовані в прилади Q Exactive Plus та Q Exactive HF. Сюди входять поліпшена стійкість, що забезпечується фільтром з низькою роздільною здатністю перед квадруполем, сегментованим квадруполем, а у випадку з приладом Q Exactive HF - аналізатором масової орбітрапи надвисокого поля, збільшенням роздільної здатності або швидкістю отримання. Ми описуємо ці можливості в контексті одноразового комплексного аналізу пептидів та фосфопептидів.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ПРОЦЕДУРИ

Побудова Q Exactive Plus

Деталі конструкції Q Exactive HF. Цей прилад заснований на серії Q Exactive і вдосконалює його за допомогою попереднього фільтра масового відбору, реалізованого на ін'єкційному флатополі (A), активно направляючому гнутому флатаполі (B) та сегментованому квадруполі (C). Ця комбінація запобігає забрудненню надходити далеко в прилад і покращує передачу іонів майже в 2 рази. Аналізатор надвисокого поля Orbitrap (D) є необов’язковим.

Діапазон охоплених мас в аналізаторі Orbitrap становить m/z 50–6000. Вибір маси попередника квадруполем можливий до m/z 2500, а вікна ізоляції можна встановити між 0,4 і 5600 Th. Програмне забезпечення приладу автоматично регулює необхідний час введення іонів, щоб компенсувати втрату передачі при зменшенні ширини ізоляції. Швидкість отримання з класичним аналізатором Orbitrap залишається незмінною, як повідомлялося раніше, тоді як для високопольового Orbitrap вона коливається від 27 Гц для роздільної потужності 15000, заданої при m/z 200 (що відповідає 10000 при m/z 400), до 1,5 Гц для роздільна здатність 240 000 при m/z 200 (що відповідає 170 000 при m/z 400). Вакуум у відділенні Orbitrap може бути електронно відрегульований у 5 разів, що дозволяє проводити аналіз з високою роздільною здатністю більшості аналітів, включаючи великі пептиди та дрібні білки.

Приготування лізатів HeLa

Збагачення фосфорилювання нестимульованих клітин HeLa

LC-MS/MS аналіз

Онлайн-хроматографію проводили за допомогою системи ВЕРХ ультрависокого тиску Thermo Easy nLC (Thermo Fisher Scientific), з'єднаної в Інтернеті з оригінальним Q Exactive або Q Exactive HF з джерелом NanoFlex (Thermo Fisher Scientific). Аналітичні колони (довжиною 50 см, внутрішній діаметр 75 мкм) упаковували в приміщення з репрофільованою смолою ReproSil-Pur C18 AQ 1,9 мкм (Dr. Maisch GmbH, Аммербух-Ентрінген, Німеччина) в буфер А (0,5% оцтової кислоти ). Під час онлайн-аналізу аналітичну колону поміщали в колоновий нагрівач (Sonation GmbH, Biberach, Німеччина) з регульованою температурою 55 ° C. Суміш пептидів 2 мкг сухої маси завантажували на аналітичну колонку з буфером А при максимальному протитиску 980 бар (як правило, призводить до швидкості потоку 450 нл/хв) і розділяли з лінійним градієнтом від 5% до 30 % буфера B (80% ACN та 0,5% оцтової кислоти) при швидкості потоку 250 нл/хв, контрольованій технологією IntelliFlow протягом 90 хв (зазвичай при зворотному тиску близько 500 бар). Завдяки завантаженню, введенню та етапам промивання загальний час для LC-MS/MS був приблизно на 40-50 хв довшим. Онлайн-контроль якості, включаючи автоматичне виявлення утворення великих крапель, параметри ВЕРХ та стан комп’ютера, пов’язаний із придбанням, проводився за допомогою SprayQc (8).

Характеристики трансмісії фільтр вибору маси. A, порівняння ефективності вікна ізоляції між Q Exactive та Q Exactive Plus з використанням повного набору іонів кальміксу. B, порівняння ефективності передачі ізоляції між Q Exactive та Q Exactive HF з використанням повного набору іонів кальміксу. С, загальні унікальні пептиди із комплексу лізату загального клітинного HeLa, секвенированного з діапазоном вікон ізоляції. Вторинна вісь y позначає вклад опції Андромеди "другий пептид" у відсотках (SecPep). D, чистота ізоляції із комплексу лізату загального клітинного HeLa, послідовно розділеного діапазоном вікон ізоляції.

У порівнянні між Q Exactive та Q Exactive HF ми помітили, що було в 1,5 рази завищено кількість іонів, запропонованих для фрагментації на Q Exactive HF, порівняно з пробігами Q Exactive. Щоб визначити, чи мало це додатковий вплив на продуктивність приладу, ми досліджували характеристики на різних цільових значеннях. З цього ми виявили, що вихідне цільове значення Q Exactive-іонів 1e5 залишалося оптимальним для Q Exactive Plus та Q Exactive HF (додатковий рис. S6).

Аналіз даних

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

Шлях іонів під час квадрупольної ізоляції Q Exactive HF (як і Plus) був оновлений з метою підвищення стійкості та оптимізації передачі іонів під час квадрупольної ізоляції, щоб мати можливість задовольнити попит, що створюється збільшеною швидкістю аналізатор маси надвисокого поля Orbitrap. Різні апаратні компоненти, що складають шлях, детально описані в “Експериментальних процедурах”. Ми починаємо наше обговорення з вивчення їх поведінки за допомогою стандартного розчину ESI для позитивного іонного калібрування (Thermo Fisher Scientific), розпиленого методом прямої інфузії. Потім ми характеризуємо продуктивність приладу на основі результатів цілісноклітинних лізатів HeLa, виміряних методами top-N дробовика.

Ін'єкційний флатопол як попередній фільтр

Характеристики характеристик ін’єкційного фільтра для попереднього нагрівання масляного фільтра. A, спектр кальміксу при ізоляції MRFA (524,27 м/z) в ізоляційному вікні 80 Th. Вставка збільшує розмірне вікно та його безпосереднє оточення. B, ефективність ізоляції фільтра попередньої маси протягом ряду вікон ізоляції. С, ефективність фільтра попередньої маси для цілого ряду вікон ізоляції на цілісноклітинному лізаті HeLa. D, зображення ін'єкційного флатополя після 3 місяців безперервних вимірювань.

Сегментований квадруполь

Оригінальний квадруполь із гіперболічним стрижнем був замінений сегментованою версією, здатною досягти більшої ефективності прямокутної ізоляції за повне вікно ізоляції (рис. 3 А). Це актуально для стратегій придбання, таких як SWATH (23) та спільної ізоляції партнерів SILAC (наприклад, у вибраних сканерах моніторингу іонів), які потребують прямокутних вікон ізоляції для отримання точної кількісної інформації по їх краях. Щодо квадруполя в Q Exactive, ми спостерігали помітно поліпшену ефективність ізоляції на стороні вікна ізоляції з низькою масою. Крім того, покращена передача квадруполя для вузьких ізолюючих вікон. Ми виміряли цю покращену ефективність для набору іонів кальміксу і виявили майже в 2 рази збільшення (рис. 2 Б). Зверніть увагу, що на малюнку також показано перевагу передачі для більших вікон ізоляції, особливо для іонів із високим m/z, що обумовлено ефектом фокусування вихідного сегмента квадруполя. Це вдосконалення приблизно відповідає збільшенню іонного струму, необхідного для підтримки подвоєння швидкості сканування, на яку здатний високопольовий аналізатор Orbitrap (оскільки час заповнення відповідає перехідному часу при повністю паралельній роботі приладу).

Продуктивність аналізатора надвисокого поля

Продуктивність Q Exactive HF з аналізатором надвисокого поля Orbitrap. A, порівняння розмірів стандарту (ліворуч) із компактним, надпольовим аналізатором Orbitrap (праворуч). B, порівняння необхідних перехідних часів Orbitrap, необхідних для різних роздільних здатностей, разом із оцінкою накладних витрат часу, необхідних для кожного сканування. С, виміряна роздільна здатність піків, виявлених із комплексу лізату загального клітинного HeLa. D, порівняння статистичних даних сканування між Q Exactive та Q Exactive Plus на загальних клітинних лізатах HeLa.

Перевірка оптимального значення параметра

Після індивідуальної оптимізації параметрів для Q Exactive HF ми провели незалежну перевірку оптимальних значень для кожного з параметрів, використовуючи підхід проектування експерименту (29, 30), використовуючи MODDE (Umetrics, Франкфурт, Німеччина). Перевагою такого підходу є те, що він дає уявлення про параметри, що мають потенційно взаємодіючі властивості. Для аналізу ми вибрали параметри, які раніше давали найбільший ефект у наших експериментах, що складаються з нормованої енергії зіткнення (20–40), частотного діапазону S-лінзи (40–80) та ізоляційного вікна (0,4–3 тис.). Діапазон параметрів був обраний великим та центром на знайдених раніше оптимальних значеннях. Усі дані RAW реєструвались на основі експериментальної конструкції, встановленої програмним забезпеченням. З результатів цього дослідження ми дійшли висновку, що описані раніше значення є оптимальними, і що в нашому наборі не було значущих взаємодіючих параметрів, від яких можна було б отримати виграш від продуктивності. Оскільки висновок залишився незмінним, і підхід до розробки експерименту може мати справу з розрідженими даними, це може бути привабливим типом дослідження для швидкої оптимізації метрик LC-MS/MS для різних типів зразків та хроматографічного розділення (додатковий рис. S10).

Q Ефективна ефективність для загального аналізу клітинного лізату

Продуктивність Q Exactive HF з аналізатором надвисокого поля Orbitrap. A, порівняння часу циклу для Q Exactive та Q Exactive HF на комплексному лізаті клітин HeLa. B, порівняння пікової глибини порівняння між Q Exactive та Q Exactive HF. С, порівняння загальної кількості видимих пептидів (кумулятивний зелений, червоний та сірий), секвентованих пептидів (кумулятивний зелений та червоний) та успішно ідентифікованих пептидів (зелений) між Q Exactive та Q Exactive HF. D, кумулятивно ідентифіковані білки за градієнтним порівнянням між Q Exactive та Q Exactive HF. Пунктирними лініями позначено лінійне прилягання до найкрутішої частини кривої.

Однією з видатних особливостей графіку часу циклу є те, що Q Exactive досягнув повної вершини N на початку градієнта, тоді як Q Exactive HF досяг повної вершини N значно пізніше в градієнті. Ми інтерпретуємо це так, що навіть у дуже складних зразках, таких як лізати повноцінних клітин HeLa, початкова частина градієнта не містить достатньої кількості іонів-попередників, які відповідають критеріям відбору для фрагментації при цих дуже високих швидкостях секвенування.

Подальші дослідження динамічного діапазону ідентифікованих пептидів показали, що обидва інструменти надійно секвенували протягом 3 порядків, що вказує на те, що збільшення продуктивності Q Exactive HF можна пояснити його здатністю секвенувати більше пептидів у зайнятих регіонах хроматографії. Ця додаткова швидкість також відповідає за більш високу відтворюваність між повторами на рівні ідентифікації пептидів, де прилад досягає кращої відтворюваності при меншій кількості пептидів (додатковий рис. S8). Щоб дослідити показники Q Exactive HF на різних довжинах градієнта та надати вказівки на оптимальні характеристики приладу, ми додатково провели серію титрування градієнта на стандартних зразках HeLa, яка показала, що градієнти протягом 4 год не сприяли подальшому покращенню ідентифікаційних характеристик наш зразок. Виходячи зі збільшення за одиницю часу, ми дійшли висновку, що градієнт 150 хв являє собою оптимальну довжину. Тенденцію в нашій та інших лабораторіях вимірювати градієнти понад 4 години або більше можна тепер до певної міри змінити (додатковий рис. S9).

Оптимізована продуктивність хроматографії. А, кумулятивні білки за градієнтом. B, скопіюйте номери на клітинку для виявлених білків.

Застосування до фосфопротеомії

Збагачені фосфорилюванням зразки. A, приклад спектрів фрагментації того самого фосфорильованого пептиду, ідентифікованого на Q Exactive (вгорі) та на Q Exactive HF (внизу). В обох випадках досягнутий максимально дозволений час введення іонів. B, порівняння досягнутої пікової глибини на Q Exactive та Q Exactive HF. С, порівняння успішно секвенсованих сайтів фосфорилювання класу I.

Висновки та прогноз

Тут ми описали наступну ітерацію сімейства мас-спектрометрів Exactive, Q Exactive Plus та Q Exactive HF, і дослідили її ефективність на аналітичних стандартах та на складних пептидних сумішах для протеоміки дробовиків, використовуючи наш стандартний 90-хвилинний градієнт. Аналізатор надвисокого поля Orbitrap подвоює швидкість секвенування при тій самій роздільній здатності, для чого поліпшені характеристики передачі іонів сегментованого квадруполя принаймні частково забезпечують необхідне збільшення вмісту іонів-попередників. Більш висока швидкість добре перекладається на фактичні вдосконалення протеоміки дробовика, оскільки ми спостерігали збільшення на понад 40% унікальних пептидних послідовностей та понад 20% білків порівняно з попереднім поколінням на нашому стандартному градієнті з лізатом клітин HeLa.

На закінчення, це нове покоління квадрупольних приладів Orbitrap розроблено для значно більшої міцності, і наші експерименти підтвердили, що більшість небажаних іонів були приурочені до передньої частини приладу. Ми також спостерігали значно посилені селекційні характеристики нового сегментованого квадруполя, що мало б бути корисним у багатьох протеомічних експериментах. Нарешті, і найголовніше, аналізатор надвисокого поля Orbitrap в Q Exactive HF регулярно забезпечував подвоєну роздільну здатність при скануванні MS без недоліків і подвоював потенційну швидкість послідовності в режимі MS/MS.

Додатковий матеріал

Подяки

Ми дякуємо нашим колегам з Thermo Fisher Scientific, особливо Андреасу Віггаузу, Маркусу Келлманну, Стевану Хорнінгу, Маттіасу Мюллеру, Амелії Петерсон, Еріку Кузіну та Айварасу Венкусу, а також в Інституті Макса Планка, особливо Корбініану Майру, Феліксу Майсснеру, Яну Ріккману, Герберту Шиллеру та Марко Хайну за допомогу та плідні дискусії. Ми також дякуємо Стівену Девіцу, Ігорю Парону та Габріеле Сові за технічну допомогу.

Ми заявляємо про конкуруючі фінансові інтереси.

Дані протеоміки на основі MS були депоновані в Консорціумі ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) через сховище партнерів PRIDE з ідентифікатором набору даних PXD001203. Щоб отримати доступ до даних, відвідайте http://tinyurl.com/nyj5hx9.

Виноски

Внески автора: R.A.S. та М.М. розроблені дослідження; R.A.S., J.H., O.L., E.Denisov, E.Damoc, A.K. та A.M. виконані дослідження; R.A.S., J.H., O.L., D.H., E.Denisov, E.Damoc, A.K. та A.M. внесли нові реагенти або аналітичні інструменти; R.A.S., J.H., O.L., D.H., E.Denisov, E.Damoc, A.K., A.M. та M.M. проаналізовані дані; R.A.S. та М.М. написав роботу.

* Дослідження, що призвело до цих результатів, отримало фінансування від 7-ї Рамкової програми Європейської Комісії (Угода про грант HEALTH-F4-2008-201648/PROSPECTS).

Ця стаття містить додатковий матеріал.