Пробіотики, виділені з яків, покращують ефективність росту, антиоксидантну активність та цитокіни, пов’язані з імунітетом та запаленням у мишей

Аоюн Лі

1 коледж ветеринарної медицини Хуачжунського сільськогосподарського університету, м. Ухань, 430070 Китайська Народна Республіка

Япінг Ван

Чжисін Лі

Хаммад Камар

Халід Мехмуд

2 Університетський коледж ветеринарних та тваринних наук, Університет Ісламії Бахавалпур, Бахавалпур, 63100 Пакистан

Ліхонг Чжан

Джуанджуан Лю

Хуей Чжан

Цзякуї Лі

3 коледж тваринництва та ветеринарної медицини, Тибетський університет сільського господарства та тваринництва, Лінчжі, 860000 Китайська Народна Республіка

Пов’язані дані

Він буде доступний за запитом.

Анотація

Передумови

Яки, що мешкають у високогірному гіпоксичному середовищі Тибетського плато (3600 м), мають особливі мікроби в кишечнику. Однак досі мало досліджень пробіотиків як. Тому метою нашого дослідження було оцінити ефект, що сприяє зростанню, антиоксидантну здатність, імунну дію та протизапальну здатність Bacillus subtilis та Bacillus velezensis, виділених із тибетських яків на моделі мишей.

Результати

Результати показали, що додавання ізольованих штамів не тільки покращує ефективність росту, але також збільшує довжину ворсинок у тонкому кишечнику та активність кишкового травного ферменту. Важливо те, що ми спостерігали, що рівні T-AOC, SOD та GSH-PX були підвищені, а вміст MDA знижений у мишей, оброблених пробіотиками, що означало, що добавки пробіотиків можуть покращити антиоксидантну активність мишей. Рівні AST та ALT, що корелювали із ураженням печінки, були знижені, а рівні AKP, TP, GLB, ALB, Ca та P були помітно вищими, ніж у контрольній групі. Крім того, миші, які отримували пробіотики, виявляли вищі сироваткові IgG, IgM та IgA, що певною мірою може відображати імунний статус. У той же час основний прозапальний фактор TNF-α, IL-6 та IL-8 був знижений, а протизапальний фактор IL-10 - регульований вгору порівняно з контрольними групами.

Висновки

На закінчення, ці результати продемонстрували, що добавки Bacillus subtilis та Bacillus velezensis можуть підвищити загальну ефективність росту та покращити показники крові, пов'язані із запаленням та імунітетом мишей.

Електронний додатковий матеріал

Інтернет-версія цієї статті (10.1186/s12934-019-1161-6) містить додаткові матеріали, доступні для авторизованих користувачів.

Передумови

Загальновідомо, що антибіотики відіграють вирішальну роль у лікуванні бактеріальних захворювань та ефективності росту тварин [1]. Однак численні дослідження показали, що обмежена годівля тварин широко застосовує антибіотики, і це спричинило зростання стійких до антибіотиків бактерій та дисбактеріоз у тварин [2, 3]. Симбіотичні бактерії можуть виявляти стійкий до антибіотиків фенотип під час частого впливу антибіотиків і, зрештою, перенесення на людей. Більше того, невибіркове використання антибіотиків у худобі спричиняє велику загрозу стану здоров’я людей та безпеці харчових продуктів через ланцюг постачання продуктів харчування [4]. Попередні дослідження показали, що у тваринництві з’явилася велика кількість проблем із забороною антибіотиків у деяких країнах, таких як зниження показників росту та спалах захворювань, які спочатку контролювались антибіотиками [5]. Тому очікувалося розробити новий клас корисних альтернатив антибіотиків. На сьогодні пробіотики розглядалися як природні замінники антибіотиків через їх багаторазовий сприятливий вплив на господаря і привертали велику увагу дослідників [6].

Яки - давні види високогірного середовища, що характеризуються пристосуванням до низьких температур та гіпоксичних умов. Згідно зі статистичними даними, 90% яків у світі в основному населяють провінції Китаю Сичуань, Тибет і Цинхай [13]. Яки могли в повній мірі використовувати трав'яні ресурси в альпійських районах і мати сильну адаптацію до своїх суворих екологічних умов. Отже, висотна гіпоксія (низький тиск і низький рівень кисню) буде чинити значний тиск на еволюційний відбір [14, 15]. Попереднє дослідження показало значну різницю в мікробних спільнотах кишечника між тибетськими, які живуть на великій висоті, та китайськими ханьцями, що мешкають на нижній частині материка, через особливі умови життя та дієтичні звички [14]. Дослідження Бригітти та Адака показали, що склад мікробіоти кишечника людини може змінюватися, коли вони за короткий час перебували на висоті [16, 17]. Це вказувало на те, що у яків також можуть бути особливі кишкові бактерії порівняно з тваринами, що живуть у рівнинній місцевості. Однак є мало повідомлень про кишкові мікроорганізми яків, і ще менше досліджень про пробіотики у яків.

У цьому дослідженні ми мали на меті оцінити вплив двох штамів Bacillus subtilis (з назвами BS1 і BS2) та одного штаму Bacillus velezensisis (з назвою BV1), виділених з яків на ефективність росту, показник органів, слизову оболонку тонкої кишки, травну здатність кишечника., антиоксидантна здатність та імунні показники мишей.

Методи

Культура пробіотиків

Два штами Bacillus subtilis (BS1 і BS2) і один штам Bacillus velezensis (BV1) були виділені з кишечника яків і консервовані в лабораторії ветеринарних внутрішніх хвороб Сільськогосподарського університету Хуачжун, Ухань, Китай. Наше попереднє дослідження продемонструвало, що BS1, BS2 та BV1 мали високу антибактеріальну ефективність проти золотистого стафілокока (ATCC 26112), кишкової палички (ATCC 25922) та Salmonella enteritidis (NCTC 13349) і мали високу толерантність до кислоти та солей жовчі [18 ]. Крім того, для визначення безпеки штамів BS1, BS2 та BV1 проводились експерименти з резистентністю до антибіотиків, генні тести на стійкість та гемолітичні експерименти. Наші попередні результати показали, що BS1, BS2 та BV1 мали нижчу антибіотикорезистентність, а гени стійкості та гемолізу не виявлені [18]. Результати оцінки безпеки показали, що виділені штами є безпечними та можуть бути використані в експериментах на тваринах [18]. Три ізольованих штами культивували в бульйоні Лурія-Бертані (LB) при температурі 37 ° С протягом 24 годин в аеробному середовищі. Потім кількість життєздатних клітин BS1, BS2 та BV1 оцінювали методом підрахунку пластин. Суспензії бактерій збирали у стерильних умовах для перорального введення мишам.

Експеримент на тваринах

П'ятнадцятиденних здорових мишей Куньмін (n = 72) було придбано в експериментальному центрі з тваринами провінції Хубей у провінції Ухань, Китай. Мишей випадковим чином поділяли на контрольну групу, групу, яка отримувала BS1, групу, яка отримувала BS2, та групу, яка отримувала BV1. Протягом усього експерименту мишам дозволяли вільно пити і годувати. Крім того, мишам у групах, оброблених пробіотиками, давали BS1, BS2 або BV1 при 1 × 10 9 КУО/добу протягом 21 дня поспіль, і контрольним мишам отримували однаковий обсяг сольового розчину за тим же методом. У кожній групі 18 мишей порівну розділили на 3 повтори. Усі миші (15–18 г) мали однакову початкову вагу та вміст поживних речовин. Мишей вирощували в пластикових клітках (розмір, 375 мм × 273 мм × 165 мм) протягом 21 доби. Під час експерименту температуру виводка підтримували від 20 до 24 ° C, вологість підтримували від 53 до 57% і щоденне освітлення проводили як 12 год для світла і 12 год для темряви. Крім того, три рази на день (кожні 8 год) реєстрували їх дієту, питну воду та загальну ефективність, смерть, діарея, депресія, втома, втрата апетиту вважалася ненормальною продуктивністю для мишей.

Збір та обробка зразків

Через 21 день годування мишей усіх груп евтаназували ін’єкцією пентобарбіталу (25 мг/кг). Потім зразки печінки, нирок, кишечника (дванадцятипалої кишки, тонкої кишки та клубової кишки) та крові відбирали негайно в стерильних умовах для подальшого дослідження. Одночасно мишей розтинали хірургічним ножем для спостереження за внутрішніми органами та зразками кишечника. Частина зібраних зразків кишечника (дванадцятипала кишка, тонка кишка та клубова кишка) приблизно 2 см, тоді як печінка, нирки та селезінка, нарізані кубиками (0,5 см × 0,5 см × 0,5 см), фіксувались у 4% параформальдегіді. З іншого боку, всі фіксовані зразки регулярно обробляли шляхом вбудовування у парафін, а гістологічні зрізи (4–5 мкм) фарбували гематоксиліном та еозином (H&E) для мікроскопічного дослідження. Решта зразків зберігали при - 80 ° C для подальшого аналізу. Зразки крові поміщали статично в пробірку центрифуги на 1 год. Потім зразки центрифугували при 3500 × g протягом 10 хв на високошвидкісній центрифузі 4 ° (H2050R-1, Чанша, Китай) і супернатанти зберігали при - 80 ° C для ІФА та біохімічного аналізу.

Аналіз ефективності виробництва

У цьому дослідженні мишей зважували у визначений час та в місцях. Крім того, реєстрували та обчислювали середньодобове споживання корму (ADFI) та середньодобовий приріст ваги (ADWG), використовуючи кожну зважену групу. Коефіцієнт конверсії корму (FCR) розраховували за такою формулою: F C R = ADFI ADG .

Морфологічний аналіз слизової оболонки тонкої кишки

Морфологію гістологічних зрізів тонкої кишки, забарвлених гематоксиліном та еозином (H&E), спостерігали за допомогою інвертного мікроскопа (Olympus BX51, Японія), а довжину та глибину кишкових ворсин вимірювали за допомогою програми аналізу зображень (Image-Pro Plus 6.1 Media Cybernetics, Роквілл, доктор медичних наук, США). Більше того, також було розраховано відношення довжини ворсинок до глибини склепу.

Активність травних ферментів, антиоксидантні показники та біохімічні показники

Печінку та тонкий кишечник гомогенізували додаванням стерильного 0,9% сольового розчину для приготування 10% (мас./Об.) Гомогенатів, і гомогенати зберігали при - 80 ° C для подальшого дослідження. Показники антиоксидантів у печінці, включаючи T-AOC, MDA, GSH-PX та SOD, та активність травного ферменту в тонкому кишечнику, включаючи α-амілазу та трипсин, вимірювали за допомогою комерційних наборів Інституту біоінженерії Нанкін Цзяньчен (Нанкін, Китай). Хоча добавки до пробіотиків мають сприятливий вплив на господаря, але деякі пробіотики можуть призвести до пошкодження печінки та бактеріємії [19]. Тому для оцінки того, чи пробіотики, виділені з тибетських яків, викликали пошкодження печінки у мишей, проводили аналіз печінкових показників. Крім того, біохімічні показники, пов’язані з печінкою (AKP, AST та ALT) та сироваткою крові (TP, GLB, ALB, Ca, P), також виконувались комерційними наборами, придбаними в Інституті біоінженерії Нанкін Цзяньчен (Нанкін, Китай). Всі операції виконуються за протоколами виробника.

Аналіз імуноглобулінів та цитокінів

Імуноглобуліни в сироватці крові, включаючи рівні IgG, IgM та IgA, і вміст цитокінів, включаючи вміст IL-6, IL-8, IL-10 та TNF-α, визначали кількісно, використовуючи миша-специфічний набір ELISA (Colorful Gene Biological Technology, Ухань, Китай) наступним чином інструкції виробника. Значення OD (оптичної щільності) кожного зразка вимірювали за допомогою зчитувача мікропланшетів Thermo Scientific при довжинах хвиль 400 нм.