Пробіотичні мікроби підтримують молоді рівні сироваткового тестостерону та розміри яєчок у старіючих мишей

Співпрацювали в цій роботі з: Теофілосом Путахідісом, Алексом Спрінгером

Відділ порівняльної медицини, Массачусетський технологічний інститут, Кембридж, штат Массачусетс, Сполучені Штати Америки, Лабораторія патології, Факультет ветеринарної медицини, Університет Арістотеля в Салоніках, Салоніки, Греція

Співпрацювали в цій роботі з: Теофілосом Путахідісом, Алексом Спрінгером

Відділ порівняльної медицини, Массачусетський технологічний інститут, Кембридж, Массачусетс, Сполучені Штати Америки, Біологічна інженерія, Массачусетський технологічний інститут, Кембридж, Массачусетс, Сполучені Штати Америки

Афілійований відділ порівняльної медицини, Массачусетський технологічний інститут, Кембридж, штат Массачусетс, Сполучені Штати Америки

Партнерська лабораторія патології, факультет ветеринарної медицини, Університет Арістотеля в Салоніках, Салоніки, Греція

Афіліації Біологічна інженерія, Массачусетський технологічний інститут, Кембридж, штат Массачусетс, Сполучені Штати Америки, Широкий інститут Массачусетського технологічного університету та Гарвард, Кембридж, штат Массачусетс, Сполучені Штати Америки

Теофілос Путахідіс,
Алекс Спрінгер,
Тетяна Левкович,
Пеймін Ці,
Бернард Дж. Варіан,
Джессіка Р. Лакриц,
Ясін М. Ібрагім,
Антоніс Чаціг'ягкос,
Ерік Дж. Алм,
Сьюзен Е. Ердман

Цифри

Анотація

Цитування: Poutahidis T, Springer A, Levkovich T, Qi P, Varian BJ, Lakritz JR, et al. (2014) Пробіотичні мікроби підтримують молоді рівні сироваткового тестостерону та розміри яєчок у старіючих мишей. PLoS ONE 9 (1): e84877. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0084877

Редактор: Стефан Шлатт, Університетська лікарня Мюнстера, Німеччина

Отримано: 30 червня 2013 р .; Прийнято: 20 листопада 2013 р .; Опубліковано: 2 січня 2014 року

Фінансування: Цю роботу підтримали гранти Національного інституту охорони здоров’я P30-ES002109 (присудження пілотного проекту SEE та EJA), U01 CA164337 (SEE та EJA) та RO1CA108854 (SEE). Фінансисти не мали жодної ролі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Вступ

Основним клітинним джерелом тестостерону у ссавців чоловічої статі є клітина Лейдіга, яка знаходиться в скупченнях всередині тестикулярного інтерстицію. Виробництво андрогенів у клітинах Лейдіга у дорослих регулюється опосередкованими лютеїнізуючими гормонами сигналами, що походять від осі гіпоталамус-гіпофіз [1]. У чоловіків неминуче зменшення циркулюючого тестостерону відбувається із збільшенням віку [2] - [4]. Механізми, що регулюють це явище, залишаються в основному невідомими. Однак дослідження як на людях, так і на гризунах показують, що низький рівень тестостерону обумовлений віковими ураженнями яєчок, а не нерегулярним метаболізмом лютеїнізуючого гормону [1], [5] - [7].

Зниження рівня тестостерону спричинено багатьма несприятливими наслідками старіння чоловіків, включаючи зниження сперматогенезу, лібідо та статевих функцій, збільшення жиру в організмі, зменшення м’язової та кісткової маси, низький рівень енергії, втома, погана фізична працездатність, пригнічений настрій та порушення когнітивна дисфункція [8] - [11]. Чи можна вважати низький рівень тестостерону причиною певної клінічної сутності у літніх чоловіків чи ні, було предметом дискусій [12]. Крім того, для опису цього стану використовуються різні назви (чоловіча менопауза, андропауза, частковий андрогенний дефіцит чоловіків, що старіють, та пізній гіпогонадизм), і різні критерії використовуються для його визначення, отже, розбіжності епідеміологічних досліджень під час звітування про його стан поширеність [12] - [13]. Тим не менше, існує безперечний консенсус у тому, що вікові прогресивні морфологічні та функціональні зміни клітин Лейдіга призводять до низького рівня тестостерону, що, в свою чергу, знижує репродуктивну придатність та впливає на якість життя старіючих чоловіків [1], [4] - [5], [9] - [10], [12] - [13].

Показано, що різні дієтичні фактори та ожиріння, спричинене дієтою, підвищують ризик пізнього чоловічого гіпогонадизму та низького виробництва тестостерону як у людей, так і у мишей. Дефіцит тестостерону та метаболічні захворювання, такі як ожиріння, здається, перетворюються між собою в складних причинно-наслідкових зв’язках [14] - [17].

Нещодавно ми виявили, що дієтичне додавання літніх мишей пробіотичною бактерією Lactobacillus reuteri робить їх молодшими, ніж їх неліковані миші-побратими, принаймні частково, викликаючи корисні покривні ефекти, що проявляються як пишне волосся [18] та інгібування ожиріння, спричинене дієтою [19]. Цікаво, що обидва ці ефекти були пов’язані з регуляторною Т-клітиною CD4 + та асоційованою з Il-10 систематичною зниженою регуляцією прозапального цитокіну Il-17 [18] - [19]. Ці результати вказують на те, що мікробіота кишечника індукує модуляцію місцевого шлунково-кишкового імунітету, що призводить до системного впливу на імунну систему, що активує метаболічні шляхи, що відновлюють гомеостаз тканин і загальний стан здоров'я. Справді, в іншому дослідженні ми виявили, що літні миші, які харчуються L. reuteri, демонструють прискорене загоєння шкірних ран, що залежить від супресивної руки імунної системи та підвищення регуляції нейропептидного гормону гіпофіза - окситоцину (рукопис подано до публікації). Під час усіх цих досліджень ми постійно спостерігали, що молоді та вікові миші, що споживають очищений організм L. reuteri, мають особливо великі яєчка та домінуючу поведінку чоловіків.

Наші попередні дослідження та спостереження, взяті разом, привели нас до гіпотези, що дієтична L. reuteri може діяти для запобігання атрофії яєчок, пов’язаної з віком та ожирінням, у мишей. Результати цього дослідження підтвердили цю гіпотезу. Яєчка у мишей, яких годували пробіотиками, були врятовані як від атрофії насіннєвих канальців, так і від зменшення площі клітин Лейдіга в інтерстиціальному клітині, характерного для нормального процесу старіння. Збереження архітектури яєчок, незважаючи на похилий вік або дієту з високим вмістом жиру, співпало з надзвичайно високим рівнем циркулюючого тестостерону. Сприятливі ефекти споживання пробіотиків були повторені виснаженням прозапального цитокіну Іл-17.

Враховуючи загострену суперечку щодо переваг та ризиків побічних ефектів замісної терапії тестостероном [9] - [10], [13], [20], дієтичний L. reuteri може запропонувати альтернативний природний підхід до профілактики пізньо початих чоловіків гіпогонадизм.

Результати

Споживання Lactobacillus reuteri збільшує вагу яєчок мишей, що харчуються звичайним харчуванням

a. Валовий вигляд безпородних швейцарських мишей-самців з пероральним лікуванням Lactobacillus reuteri у віці 12 місяців. Насінники мишей, яких годували L. reuteri, більші порівняно з контрольними мишами. б – е. Результати статистичного аналізу ваги яєчок у різні моменти часу після початку лікування, включаючи (b) 5, (c) 7, (d) 9 і (e) Часові показники віку 12 місяців. L. reuteri постійно збільшував вагу яєчок як у контрольних, так і у нових мишей, що годувались західними дієтами, порівняно з контролем, який відповідав віку та дієті. Дієтичні добавки з L. reuteri, але не з E coli K12, збільшили вагу яєчок у мишей, які годувались контрольною дієтою, у віці 7 місяців порівняно з контролем, відповідним за віком та дієтою (c). Числа на осі y стовпчастих графіків відповідають середньому значенню ± SEM ваги яєчок або ваги яєчок; * p Рисунок 2. Дієтичний L. reuteri збільшує площу профілю поперечного перерізу насіннєвих канальців та популяцію їх статевих клітин.

a. Репрезентативна гістологія насіннєвих канальців у перерізі профілів швейцарських мишей у віці 5 місяців. Збільшена маса яєчок завдяки споживанню L. reuteri у мишей, що годувались як контрольною, так і новою західною дієтою (NWD), одночасно існувало з гістологічно помітним збільшенням площі поперечного перерізу насіннєвих канальців (ST). Гематоксилін та еозин. Стовпчики = 100 мкм. b. Гістоморфометрична оцінка розміру кругових профілів поперечного перерізу ST в різні моменти часу. Ефект L. reuteri залишається дуже значним із прогресуванням віку. Числа на осі y гістограм відповідають середньому значенню ± SEM розміру площі ST; *** p Рисунок 3. Споживання L. reuteri збільшує розмір інтерстиціальних площ клітин Лейдіга та кількість клітин Лейдіга.

a. Репрезентативна гістологія яєчок швейцарських мишей у віці 12 місяців. Площі клітин Лейдіга в тестикулярному інтерстиції мишей, що харчуються пробіотиками, мають збільшені розміри порівняно з відповідними ділянками контрольних мишей. Гематоксилін та еозин. Стовпчики = 100 мкм b. Гістоморфометричний підрахунок площ клітин Лейдіга в різні моменти часу виявив статистичну значимість ефекту L. reuteri. Числа на осі y стовпчастих графіків відповідають середньому значенню ± SEM розміру площі Лейдіга. c. Підрахунок точок стереології показує, що яєчка миші, вигодовані L. reuteri, значно збільшили обсяги ядер та збільшили кількість клітин Лейдіга на один яєчко. Числа на осі y стовпчастих графіків відповідають середньому значенню ± SEM "Ядерний об'єм статевих клітин на одиницю площі" або "абсолютний ядерний об'єм статевих клітин"; * p Рисунок 4. L. reuteri збільшує проліферацію клітин Лейдіга та рівень тестостерону в сироватці крові.

a. У віці 5 місяців у інтерстиції яєчка існувала невелика кількість проліферуючих (Ki-67 +) клітин Лейдіга (стрілки). Проліферуючих клітин Лейдіга було значно більше у мишей, яких годували пробіотиками. DAB хромоген, гематоксиліновий фарба. Стовпчики = 25 мкм. Вісь y гістограми означає середнє значення ± SEM клітин Ki-67 + Leydig. b. Рівень тестостерону в сироватці крові значно вищий при споживанні L. reuteri, порівняно з контролем, відповідним до дієти. Числа на осі y відповідають середньому значенню ± SEM рівня сироваткового тестостерону в нг/мл .; * p Рисунок 5. Дієтичний L. reuteri рятує мишей від вікової атрофії яєчок.

a. Представницька гістологія яєчок швейцарської миші у віці 12 місяців. Старі контрольні яєчка миші продемонстрували атрофічні насіннєві канальці. Навпаки, у мишей, що годували L. reuteri, був рівномірно нормальний епітелій ST з рідкісними атрофічними канальцями. Гематоксилін та еозин. Стовпчики = 100 мкм. Вісь y на гістограмі означає середнє значення ± SEM відношення атрофічного/загального ST, врахованого в кожній експериментальній групі; ** p Рисунок 6. Системне виснаження IL-17 рекапітулює репродуктивні властивості L. reuteri.

У порівнянні з підробленими контрольними мишами, які отримували IgG, у 12-місячних мишей, виснажених IL-17A, було a. збільшення парної ваги яєчок; b. збільшені площі поперечного перерізу ST; c. збільшення обсягів ядерних зародків; d та e. збільшення інтерстиціальних площ клітин Лейдіга. Гематоксилін та еозин. Бруски = 100 мкм; f. збільшені обсяги ядерних клітин Лейдіга та загальна кількість на яєчко і g. зниження атрофії ST. * p 5 організмів/миша/день, або підроблена E coli K12 3,5 × 10 5 організмів/миша/день у питній воді. Питну воду замінювали двічі на тиждень.

Системне виснаження інтерлейкіну-17А з використанням антицитокінових антитіл

Мишей у віці 6 місяців і старше отримували внутрішньочеревну ін’єкцію анти-IL17A антитіла (клон 17F3; BioXcel, Ліван, NH) по 500 мкг на мишу тричі на тиждень протягом щонайменше чотирьох тижнів. Потім мишей евтаназували і порівнювали з мишами, які відповідали віку, які отримували лише підроблені антитіла до IgG, що відповідають ізотипу.

Вимірювання тестостерону в сироватці крові

Кінцеві забори серцевої крові проводили під час евтаназії в середині дня, щоб нормалізувати вплив циркадного ритму на тестостерон. Аналіз RadioImmunoAssay (RIA) проводився з використанням набору загального тестостерону RIA Coat-A-Count (Siemens Diagnostics CA) у виконанні AniLytics Inc (Gaithersburg MD).

Кількісна оцінка якості сперми

Після гуманної евтаназії з використанням С02 обидва яєчка були виділені для видалення комбінованих тканин епідидимуму та судин у конкретної миші-самця. Тканину негайно поміщали в пластикову чашку Петрі і занурювали в 1 мл розчину FHM (спеціальне середовище, Millipore). Під розсікаючим мікроскопом сперму мобілізували з кожного придатка яєчка та сім’явивідної протоки за допомогою мікродисекції голкою 16 G. Блюдо поміщали в інкубатор CO2 при температурі 37 ° С на 10 хвилин, щоб забезпечити повну мобілізацію сперми. Потім сперму суспендували 1-10 з допомогою FHM для оцінки концентрації сперми за допомогою гемоцитометра (Fisher). Концентрацію сперми/мл розраховували, використовуючи (Коефіцієнт розведення) × (кількість підрахунків у 5 квадратах) × (0,05 × 10 6). Активність сперми оцінювали як кількість сперми, що активно рухається/загальна кількість сперми [54] - [56].

Гістопатологія та імуногістохімія

Для гістологічної оцінки яєчка фіксували у формалізованому нейтральним буфером, розрізали поперек навпіл, вкладали у парафін і вирізали на 4 мкм або на 10 мкм для стереології. Серійні зрізи фарбували гематоксиліном та еозином та імуногістохімією (IHC). Кролицькі моноклональні анти-Ki-67 (Cell Marque, Rocklin, CA) або поліклональні антирозщеплені каспази-3 (Cell Signaling, Beverly, MA) використовували для IHC. Тепло-індуковане отримання антигену проводили за допомогою розчину для отримання епітопу CC1 (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) для ki-67 або цитратним буфером pH6 для каспази-3.