Межі у фармакології

Етнофармакологія

Ця стаття є частиною Теми дослідження

Лікарські рослини для серцево-судинних та нейродегенеративних захворювань, пов’язаних зі старінням: від лавки до ліжка Переглянути всі 20 статей

Редаговано
Юхуа Сю

Університет науки і технологій Макао, Макао

Переглянуто
Бін Ген

Лікарня Фувай, Китайська академія медичних наук та Медичний коледж Пекінського союзу, Китай

Янфей Лю

Пекінський університет китайської медицини, Китай

Приналежності редактора та рецензентів є останніми, наданими в їхніх дослідницьких профілях Loop, і вони можуть не відображати їх ситуацію на момент огляду.

вплив

  • Завантажити статтю
    • Завантажте PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Додаткові
      Матеріал
  • Експортне посилання
    • EndNote
    • Довідковий менеджер
    • Простий текстовий файл
    • BibTex
ПОДІЛИТИСЯ НА

СТАТТЯ Оригінального дослідження

  • 1 лікарня Гуан’аньмень, Китайська академія китайських медичних наук, Пекін, Китай
  • 2 лікарня Сіюань, Китайська академія китайських медичних наук, Пекін, Китай
  • 3 Пекінський університет китайської медицини, Пекін, Китай

Вступ

Атеросклероз є загальною патологічною основою багатьох серцево-судинних захворювань (ССЗ). Хоча гіполіпідемічні препарати, інтервенційна терапія та інші традиційні методи лікування широко використовуються для зменшення загрози здоров’ю людей, атеросклероз та пов'язані з ним ССЗ все ще є основною причиною смерті у всьому світі (Anderson et al., 1991; Vilahur et al., 2014). Атеросклероз супроводжується дисліпідеміями, включаючи підвищений рівень холестерину ліпопротеїдів низької щільності (LDL-C), загального холестерину (TC), тригліцеридів (TG) тощо (Ju et al., 2018). Статини є першою лінією фармакотерапії при дисліпідеміях та ефективно контролюють рівень ліпідів та зменшують основні несприятливі серцево-судинні події (MACE) (Catapano et al., 2016; Kobiyama and Ley, 2018). Однак, як повідомляється, статини корелюють з різними побічними явищами, пов’язаними з міопатією, захворюваннями нирок, гепатобіліарними розладами та іншими подіями (Law and Rudnicka, 2006). Крім того, атеросклероз вважається хронічним запальним захворюванням великих та середніх артерій (Ross, 1999; Libby, 2002; Hansson, 2005), із змінами в запальних цитокінах, таких як фактор некрозу пухлини-альфа (TNF-α ), інтерлейкін (IL) -6 та IL-1β, а також протизапальні цитокіни, включаючи IL-10 (Tedgui and Mallat, 2006). Роль цих цитокінів у розвитку, прогресуванні та ускладненнях атеросклерозу була розглянута (Tedgui and Mallat, 2006).

Дослідження, проведені протягом останнього десятиліття, показали, що мікробіота кишечника пов'язана з певними захворюваннями людини, включаючи ожиріння (Boulange et al., 2016), діабет 2 типу (Qin et al., 2012), гіперхолестеринемія (Martinez et al., 2009) та ССЗ (Tang et al., 2017), які всі пов’язані з атеросклерозом (Jonsson and Backhed, 2017). Роль мікробіоти кишечника в атеросклерозі почали оцінювати в останні роки, в основному, включаючи регуляцію запалення та імунітету, а також метаболізм холестерину та ліпідів мікробіотою кишечника та його метаболітами (Jonsson and Backhed, 2017; Ma and Li, 2018) . Ці висновки підкреслили великі потенційні профілактичні та терапевтичні переваги атеросклерозу, які можуть бути реалізовані шляхом націлювання на мікробіом кишечника.

Берберин (BBR) - алкалоїд ізохіноліну, який можна виділити з різних лікарських рослин, таких як Coptis chinensis Франч і Кора феллодендрі. BBR виконує різні біологічні функції, включаючи протизапальну активність, поліпшення рівня холестерину та ліпідного обміну, а також профілактику метаболічних захворювань. Ці функції також дуже важливі для ефекту проти атеросклерозу. Нутрицевтичні препарати, що містять BBR, можуть суттєво знизити рівень ЛПНЩ у плазмі пацієнтів із гіпертолестеринемічною непереносимістю статинів (Marazzi et al., 2011). Інше дослідження показало, що при застосуванні низьких доз статинів та/або езетимібу більшість пацієнтів з ішемічною хворобою серця (ІХС), які не переносили високі дози статинів, можуть досягти цільових рівнів ХС ЛПНЩ протягом 3-6 місяців (Marazzi et al., 2019 ). Слід зазначити, що терапевтичний вплив BBR на ці запальні та метаболічні захворювання, такі як діарея, що виникає легкої форми (Yue et al., 2019), виразковий коліт (Cui et al., 2018), ожиріння (Xie et al., 2011; Zhang та ін., 2015), гіперліпідемія (Wang et al., 2017) та діабет (Zhang et al., 2012), схоже, пов’язані з регуляцією мікробіоти кишечника.

Попередні дослідження показали, що антиатеросклеротичний ефект BBR може бути пов'язаний зі змінами мікробіоти кишечника, зокрема, збільшенням кількості Аккермансія, змінена велика кількість Firmicutes та Verrucomicrobia та зменшення триметиламіну в сироватці крові N-рівні оксиду (TMAO) (Zhu et al., 2018; Shi et al., 2018). Однак конкретна зв'язок ролі BBR у мікробіоти кишечника з атеросклерозом та потенційний механізм досі невідомі. Тому ми досліджували кореляцію впливу BBR (високих та низьких доз) на мікробіоти кишечника із полегшенням стану атеросклерозу, включаючи поліпшення площі нальоту, рівня ліпідів у сироватці крові та системного запалення. Результати секвенування 16S рРНК та метагеномний аналіз показали, що антиатеросклеротичний ефект високих та низьких доз BBR може бути частково пов’язаний зі змінами складу та функцій мікробіоти кишечника, які можуть бути пов’язані з протизапальною та метаболічною діями глюкози та ліпідів.

Матеріали та методи

Модель тварини

Аналіз ураження зубного нальоту

Тканини серця, що містять дугу аорти, вирізали від проксимального кореня аорти до гілки клубової артерії та помістили в 4% параформальдегідне середовище на 6 год. Площа атеросклеротичного ураження аорти була оцінена за en face Масляно-червоне фарбування O, як описано раніше (Shi et al., 2018). Вимірювання розміру ураження базувалося на фарбуванні гематоксиліном та еозином ділянок парафінового кореня аорти. Площу та розмір ураження аналізував сліпий спостерігач за допомогою програмного забезпечення Image J.

Вимірювання сироваткових ліпідних профілів

Зразки крові відбирали з ретроорбітального сплетення після нічного голодування і центрифугували, і сироватку негайно зберігали при -80 ° C. Вимірювання рівнів TC, TG, LDL-C, ліпопротеїдів високої щільності (HDL-C), дуже LDL-C (VLDL-C), ліпопротеїдів (a) [Lp (a)], аполіпопротеїнів B100 (ApoB100) та Аполіпопротеїн A-1 (APOA-1) виготовляли за допомогою ферментативних методів в моделі автоматизованого біохімічного аналізатора AD2700 (Olympus, Токіо, Японія).

Вимірювання запальних цитокінів

Рівні запальних цитокінів у сироватці крові, включаючи TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 та адипонектин (ADPN), вимірювали за допомогою наборів ІФА (Abcam, Кембридж, Великобританія) відповідно до інструкцій виробника. Рівень високочутливого С-реактивного білка (Hs-CRP) вимірювали нефелометрічним імунологічним аналізом.

Екстракція ДНК калу та ампліфікація ПЛР

Високопродуктивне секвенування та аналіз біоінформатики

Для обробки послідовності генів 16S рРНК використовувались програми USEARCH (Edgar, 2010), QIIME v.1.9.1 (Caporaso et al., 2010) та VSEARCH (Rognes et al., 2016). Зчитування парного кінця Illumina контролювалося якістю FastQC v.0.11.5 (Andrews, 2010), а USEARCH було використано для приєднання до парного читання та перейменування. Видалено штрих-коди та праймери, а також виконано фільтр якості та видалено непотрібні зчитування. Усі химерні послідовності 16S рРНК були виявлені та видалені за допомогою алгоритму UCHIME проти бази даних RDP Gold (Едгар, 2013). Нехимерні послідовності були відсортовані за чисельністю та згруповані в оперативні таксономічні одиниці (OTU) за допомогою алгоритму UNOISE (поріг 100% схожості) з видаленими послідовностями з низьким вмістом (вісім послідовностей). Таблиця OTU була створена з використанням програмного забезпечення VSEARCH, і репрезентативна послідовність кожного OTU була класифікована алгоритмом класифікатора RDP щодо бази даних SILVA128 з довірчим порогом 70%.

Будівництво бібліотеки та метагеномічне секвенування

Кваліфікований екстракт ДНК був розбитий на середній фрагмент розміром 300 п.о. приблизно за допомогою Covaris S220 (Covaris, Inc., MS, США) для побудови парних бібліотек за допомогою NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (NEB, Пекін, Китай ). Парне секціонування проводили на Illumina HiSeq4000 (Illumina Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія, США) з використанням HiSeq 4000 Reagent Kits v2 за вказівками виробника.

Контроль якості послідовності та складання генома

SeqPrep 2 використовувався для відокремлення послідовностей адаптерів від 3 ′ і 5 ′ кінця парних зчитувань. Низькоякісні показники з недостатньою довжиною або значенням якості були усунені за допомогою Серпа 3. Зчитування вирівнювались до послідовностей ДНК господаря за допомогою BWA 4, який видаляв забруднені зчитування з високою схожістю вирівнювання. MEGAHIT (Li et al., 2015) був використаний для збору даних метагеноміки, а контиги довжиною понад 300 п.н. використовувались як остаточний зібраний результат.

Прогнозування генів, таксономія та функціональна анотація

MetaGene (Noguchi et al., 2006) був використаний для прогнозування відкритих рамок зчитування (ORF) зібраних контигів. Прогнозовані ORF довжиною понад 100 п.н. переводили в амінокислотні послідовності згідно з таблицею перекладів Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI).

Усі передбачені гени були згруповані за допомогою CD-HIT (Fu et al., 2012) (параметри: 95% ідентичності, 90% охоплення). Репрезентативні послідовності були обрані з найдовших послідовностей у кожному кластері для побудови не-надлишкового каталогу генів. SOAPaligner (Li et al., 2008) був використаний для зіставлення зчитувань після контролю якості до каталогу непотрібних генів із 95% ідентичністю, і оцінено чисельність генів у відповідних зразках.

Типи послідовностей, що не є надлишковими, були вирівняні до бази даних NCBI NR (усічення значення e до 1e –5) за допомогою BLASTP (версія 2.2.28 +) (Altschul та ін., 1997) та отримані додаткові таксономічні анотації. BLASTP проти бази даних Кіотської енциклопедії генів і геномів (KEGG) було проведено для визначення анотації KEGG. KOBAS 2.0 був використаний для функціональної анотації на основі результатів порівняння.

Статистичний аналіз

Дані виражаються як середнє значення ± SEM. Частина аналізу 16S рРНК проводилася в програмному забезпеченні R. Крім того, диференціальні рівні атеросклеротичних бляшок, ліпідів, запальних цитокінів та велику кількість потенційних біомаркерів кишечника на рівні роду тестували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA), після чого проводили тест множинних порівнянь. Тест суми рангу Крускала-Уолліса був використаний для перевірки диференціальної чисельності функціонального роду та шляхів KEGG. A стор-значення ∗∗∗ стор ## стор ### стор 0,05) (Малюнок 2).

Малюнок 2. Берберин покращує рівень ліпідів у сироватці крові у мишей ApoE -/-, що харчуються HFD. (A) Загальний холестерин, (B) тригліцериди, (C) холестерин ліпопротеїдів низької щільності, (D) холестерин ліпопротеїдів високої щільності, (E) холестерин ліпопротеїдів дуже низької щільності, (F) ліпопротеїн (а), (G) Аполіпопротеїн В100 та (H) Аполіпопротеїн А-1. Дані виражаються як середнє значення ± SEM (n = 12). Відмінності між групами оцінювали за односторонньою ANOVA. ∗ стор ∗∗ стор ∗∗∗ стор # стор ## стор ### стор 0,05). Більше того, рівні цих запальних цитокінів суттєво відрізнялись між високою та низькою групами (стор 0,05) (рис.3).

Малюнок 3. Берберин покращує системне запалення. (A-F) Рівні TNF-α, IL-1β, IL-6, Hs-CRP, IL-10 та ADPN у сироватці крові. Дані виражаються як середнє значення ± SEM (n = 12). Відмінності між групами оцінювали за односторонньою ANOVA. ∗ стор ∗∗∗ стор # стор ### стор 8) та небактеріальних послідовностей (таких як мітохондрії), отримано 1085 OTU із середнім значенням 25 801 послідовності на зразок (діапазон: 21 577-46 467), що становить 75,3% від загальної кількості послідовностей.

Таблиця OTU була нормалізована до мінімальної кількості зчитувань (21 577) на вибірку, а потім було проведено порівняння розмаїття. Аналіз альфа-різноманітності не виявив суттєвої різниці в різноманітності мікробіоти кишечника між кожною групою на основі індексів Чао 1 та Шеннона (стор > 0,05) (Рисунки 4А, В). PCoA, заснований на відстані Брея Кертіса, був використаний для візуалізації різниці у складі бактеріальних спільнот. Композиційна структура громади відрізнялася у чотирьох групах, серед яких групи Висока та Модель та Групи Низької та Моделі суттєво відрізнялись (стор ∗ стор ∗∗ стор 0,2%. Загалом було відібрано 116 бактеріальних OTU, і всі репрезентативні послідовності були використані для створення дерева ML (додатковий малюнок S1). На рівні роду було позначено 116 OTU, а кольорові діапазони визначали тип, до якого належали OTU. Ці OTU в основному поширюються у фірмах Firmicutes та Bacteroidetes, та Lachnospiraceae_NK4A136_group і неназначений рід. Теплова карта була використана для позначення відносної кількості OTU, а OTU з більшим вмістом в основному розподілялися в Алобакулум, Паличка, Lachnospiraceae_NK4A136_group, Блаутія, і т. д. Зовнішній шар був доданий із позначеннями кола на сімейному рівні.

Малюнок 7. (A) LEfSe аналіз порівнянь шляхів KEGG на рівнях 1 (LDA> 2,5, P 0,05). Бутират утворюється шляхом конденсації двох молекул ацетил-КоА, а потім відновлення до бутирил-КоА, який згодом перетворюється в бутират класичним шляхом (Koh et al., 2016). Спостерігалося, що гідролаза ацетил-КоА (K01067) була більш збагаченою у модельній групі порівняно з високими дозами (стор ### стор 0,05, малюнки 9C, D).

Малюнок 9. Різниця в достатку у специфічних мікроорганізмах КО для виробництва ТМАО. ** стор # стор -/- миші. Ми спостерігали зміни рівня ліпідів та запальних цитокінів у сироватці крові, а також структуру та функції мікробіоти кишечника після лікування різними дозами BBR та корелювали ці зміни з атеросклерозом. Лікування BBR послаблювало атеросклероз, спричинений HFD, зменшувало атеросклеротичні бляшки та зони ураження та покращувало рівень ліпідів у сироватці крові та запальних цитокінів. Ефекти високої дози BBR були більш значними, ніж ефекти низької дози. Секвенування ампліконів 16S рРНК показало, що BBR суттєво змінив композиційну структуру мікробіоти кишечника, і різні дози BBR показали різні зміни. Подальший аналіз фактору навколишнього середовища та метагеномної функції показав вплив BBR на запалення, метаболізм глюкози та ліпідів та продукцію ТМАО в мікробіоті кишечника.

Підвищений рівень ліпідів є основним фактором ризику розвитку атеросклеротичних ССЗ. Оскільки Kong та ін. (2004) визначили BBR як новий препарат, що знижує рівень холестерину (Kong et al., 2004), терапевтичний ефект BBR на дисліпідемію підтверджений і додатково досліджений в останні роки (Kong et al., 2008; Zhang et al., 2008). Дослідження, проведені у пацієнтів з дисліпідемією та мишами з гіперліпідемією, показали, що BBR суттєво знижує рівень ТК, ТГ та ЛПНЩ у сироватці крові (Kong et al., 2004; Zhang et al., 2008). Крім того, ці результати були підтверджені двома мета-аналізами (Lan et al., 2015; Ju et al., 2018), які також повідомляли про підвищення рівня ЛПВЩ після лікування BBR. Сучасні результати продемонстрували, що як високі, так і низькі дози BBR суттєво знижували рівні TC, APOB100 та VLDL-C, тоді як рівні TG, HDL-C, LDL-C та LP (a) знижувались лише у високій групі. Наші результати не вказують на підвищення рівня ЛПВЩ після лікування BBR. APOA-1 має антиатерогенну дію, а ін’єкція APOA-1 може зменшити внутрішньоклітинний рівень холестерину у мишей ApoE -/- (Pourcet and Staels, 2016; Gaddis et al., 2018). Однак у нашому дослідженні не спостерігалося значного збільшення знижених рівнів APOA-1 у мишей, які атеросклерозували, використовуючи високу або низьку дозу BBR.

Наше дослідження має деякі обмеження. Враховуючи той факт, що кількість зразків порівняно невелика, переконливість результатів обмежена. Хоча ми пояснили взаємозв'язок між регуляторним впливом BBR на мікробіоти кишечника та зменшенням атеросклерозу на основі секвенування 16S рРНК та метагеномічного аналізу, все ще необхідні подальші експерименти з перенесення фекальних бактерій, щоб з'ясувати прямий зв'язок BBR на мікробіоти кишечника з атеросклерозом. Це дослідження було проведено на мишах ApoE -/-, яких годували HFD. У майбутньому дослідженні ми повинні поширитись на пацієнтів з клінічним атеросклерозом, щоб далі вивчити взаємозв'язок впливу BBR на мікробіоти кишечника та атеросклероз.

Висновок

На закінчення, як високі, так і низькі дози BBR можуть покращити рівень ліпідів та запалення в сироватці крові та полегшити атеросклероз на мишачій моделі атеросклерозу, індукованого HFD. Цей антиатеросклеротичний ефект BBR може бути частково пов'язаний із змінами складу та функцій мікробіоти кишечника, які можуть бути пов'язані з протизапальною активністю та метаболізмом глюкози та ліпідів. Крім того, різні дози BBR мали різні ефекти, серед яких ослаблення атеросклерозу було більш очевидним при високій дозі BBR, але зміни складу та функцій мікробіоти кишечника показали різну чутливість до дози BBR.

Заява про доступність даних

Набори даних, створені для цього дослідження, можна знайти в базі даних Sequences Read Archive у NCBI під номером приєднання PRJNA579048.

Заява про етику

Дослідження на тваринах було розглянуто та схвалено Комітетом з розслідування тварин Пекінського університету.