Постнатальне програмування метаболізму глюкокортикоїдів у щурів модулює регуляцію впливу та чутливості глюкокортикоїдів вісцеральної жирової тканини на глюкокортикоїди та експресію гена адипонектину та прозапальних адипокінів у дорослих

Анотація

ЦІЛЬ -Зміни перинатального середовища, що призводять до збільшення поширеності метаболічного синдрому у дорослому віці, запрограмують регуляцію системного та/або жирової тканини метаболізму глюкокортикоїдів (11β-гідроксистероїддегідрогеназа типу 1 [11β-HSD-1] індукована реактивація кортикостерону). Ми висунули гіпотезу про те, що постнатальне програмування може модулювати порушення жирової тканини, викликане порушенням жирової тканини, у зрілому віці.

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ -Ми порівняли наслідки хронічної (після відлучення) дієти з високим або низьким вмістом жиру у постнатальних нормофідованих (контроль) або перегодованих (запрограмованих) щурів.

РЕЗУЛЬТАТИ—Постнатальне програмування підкреслювало надмірну вагу, спричинену дієтою з високим вмістом жиру, резистентність до інсуліну, непереносимість глюкози та зменшення адипонектину жирової тканини, що циркулює та епідидиму. Жодна маніпуляція не змінила функції печінки. Постнатальне програмування або дієта з високим вмістом жиру збільшили системне вироблення кортикостерону, яке не було додатково змінено, коли обидві маніпуляції були пов’язані. Постнатальне програмування пригнічувало індуковане дієтою з високим вмістом жиру зниження чутливості до мезентеріальної жирової тканини (МАТ) до глюкокортикоїдів та спричинене підвищенням рівня експозиції глюкокортикоїдів MAT, спричинене посиленою експресією гена MAT 11β-HSD-1. Фактор некрозу пухлини MAT (TNF) -α, TNF-рецептор 1, інтерлейкін (IL) -6, резистин та інгібітор активатора плазміногену-1 мРНК не змінювались під час годування з високим вмістом жиру у контрольних щурів і демонстрували значне збільшення запрограмованих тварин, з цим ефектом, посиленим завдяки дієті з високим вмістом жиру для TNF-α та IL-6.

ВИСНОВКИ -Наші дані вперше показують, що післяпологові маніпуляції програмують підвищену жирову дієту, підвищену регуляцію експозиції глюкокортикоїдів МАТ, чутливості та запального стану, а отже, виявляють ключову роль середовища у перинатальний період у розвитку жирової тканини, спричиненої дієтою порушення регуляції в зрілому віці. Вони також наполягають на необхідності проведення клінічних випробувань зі специфічними інгібіторами 11β-HSD-1.

11β-HSD-1, 11β-гідроксистероїддегідрогеназа типу 1
AUC, площа під кривою
C/EBP, CCAAT/енхансер-зв'язуючі білки
CHF, контроль дієти з високим вмістом жиру
ХЛН, контролюйте дієту з низьким вмістом жиру
Є, епідидимальна жирова тканина
FFA, вільна жирна кислота
GR, глюкокортикоїдний рецептор
ІЛ, інтерлейкін
МАТ, брижова жирова тканина
PAI, інгібітор активатора плазміногену
PHF, запрограмована дієта з високим вмістом жиру
PLF, запрограмована дієта з низьким вмістом жиру
PPAR, рецептор, активований проліфератором пероксисоми
ФНО, фактор некрозу пухлини
TNF-R1, рецептор TNF 1

ДИЗАЙН ДИЗАЙН І МЕТОДИ

Усі експериментальні процедури були затверджені місцевим комітетом з догляду та використання тварин. Щури Wistar (Janvier, Le Genest St. Isle, Франція) утримувались у стандартних умовах освітлення (12-годинний цикл світло/темрява; освітлення вмикається о 06:00 год.) Та температури (22–24 ° C), з вільним доступом до крана вода і стандартна гранульована дієта. Жінки-діви були спаровані. На малюнку 1 зображений експериментальний протокол. У післяпологовий день 3 самців цуценят із дев'яти послідів змішували і випадковим чином перерозподіляли (10 новонароджених для нормофідних щурів [контроль] або 3 щенят для перегодованих щурів [запрограмовано]) серед 9 матерів. Пізніше тварин залишали безперешкодними, за винятком зважування та очищення клітки в післяпологовий день 8 та 14. Щурів відлучали на постнатальний день 21 і давали або з низьким вмістом жиру (3,2 ккал/г; ліпіди 3,1%, білки 16,1%, вуглеводи у вигляді кукурудзяного крохмалю 23,0% і у вигляді сахарози 37,0%, вітаміни та мінерали 5,0%, вологість 15,8%; SAFE, Villemoisson-sur-Orge, Франція) або з високим вмістом жиру (5 ккал/г, ліпіди як сало 30,0%, білки 16,1%, вуглеводи як сахароза 37,0%, вітаміни та мінерали 5,0%, вологість 11,9%; БЕЗПЕКА) дієта ad libitum.

Базальні та динамічні дослідження.

У дорослому віці шість випадково відібраних щурів на групу поміщали в метаболічні клітини на 2-тижневий період аклімації; потім сечу збирали для вимірювання кортикостерону. Всім дорослим щурам (у віці 5 місяців) голодували протягом ночі та вводили внутрішньочеревно 1,5 мг/г d -глюкози (30% розчин у фізіологічному розчині). Зразки крові брали під легкою анестезією Форена методом венекції хвоста перед ін'єкцією та через 30 та 120 хв після навантаження глюкозою. Тиждень потому згодованих щурів вбивали швидким безстресовим обезголовленням між 1400 та 1600 год. Кров у стовбурі збирали в пробірки з 5% розчином ЕДТА або без нього. Кров центрифугували при 4000 об/хв протягом 20 хв при 4 ° C, і отриману плазму або сироватку зберігали до температури -70 ° C до аналізу. Печінкові та білі жирові прокладки зважували та заморожували або вкладали парафін. Тканини зберігали при -70 ° C до подальшої обробки.

Аналізи.

Кортикостерон аналізували в сечі після екстракції дихлорметану за допомогою радіоімунологічного аналізу, як описано раніше (20). Глюкозу в плазмі та вільні жирні кислоти (FFA) вимірювали за допомогою ферментативних методів (Biomérieux, Marcy l'Etoile, Франція та Oxoid, Dardilly, Франція, відповідно). Інсулін плазми та адипонектин аналізували за допомогою радіоімунологічного аналізу (Linco Research, St. Charles, MO).

Гібридизація in situ та морфологічний аналіз.

Зрізи (12 або 20 мкм) вирізали в кріостатичному мікротомі при −20 ° C у печінці або в жировій тканині епідидимуму (EAT) та мезентеріальній жировій тканині (MAT). Секції розморожували на слайдах, покритих желатином, сушили на нагрівачі для предметних стекол і витримували при -70 ° C. Гібридизацію in situ проводили за раніше описаною (21). Глюкокортикоїдні рецептори (GR), 11β-HSD-1, TNF-α, TNF – рецептор 1 (TNF-R1), інтерлейкін (IL) -6, резистин, адипонектин, PEPCK, інгібітор активатора плазміногену (PAI) -1 та пероксисома γ-антисмислові зонди з активацією проліфератора (PPAR) генерували транскрипцією in vitro у присутності 35 S-уридин-трифосфату (Perkin Elmer, Париж, Франція) з кДНК, вставлених у скрипт pPCR і відповідаючих підставам 1617-2150, 18-271, 24-272, 998-1284, 727-1004, 6-186, 54-355, 174-531, 1346-1788 та 1080-1587 відповідних мРНК. Слайди піддавали дії рентгенівських плівок (BIOMAX MR; Kodak, Ле Понте, Франція) разом зі стандартами 14 С. Гібридизація з сенсорними зондами не показала сигналу, демонструючи специфічність зондів (не показано). Сигнали гібридизації кількісно визначали на авторадіограмах плівки за допомогою програмного забезпечення Image та перетворювали в nCi/g, використовуючи стандарти 14 C. Поверхню адипоцитів вимірювали на фарбованих зрізах парафінової жирової тканини (шість випадково вибраних полів на депо на щура).

Статистичний аналіз.

Дані представлені як середні значення ± SE. Статистичний аналіз проводили за допомогою програми аналізу Statview з використанням двосторонньої ANOVA з подальшим багаторазовим порівняльним тестом Фішера. Для порівняння поверхонь адипоцитів використовували пробу Колмогорова-Смірнова. Площа під кривою (AUC) для глюкози в плазмі, інсуліну та FFA розраховували за допомогою трапецієподібного методу. Лінійний регресійний аналіз проводили для виявлення корелятів жирової тканини 11β-HSD-1, а коваріаційний аналіз (програмне забезпечення SPSS; SPSS, Чикаго, Іллінойс) проводили для змінних, які виявились P Перегляньте цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно

Вплив постнатального перегодовування та дієти з високим вмістом жиру на вагу тіла та жирових прокладки, поверхню адипоцитів та метаболічні параметри циркуляції

У тварин, що голодували, глікемія не відрізнялася між групами, тоді як інсулінемія, плазмові жирні речовини та співвідношення інсуліну до глюкози посилювались у щурів CHF та PLF порівняно з щурами CLF та додатково збільшувались у щурів PHF. Внутрішньочеревинний тест на толерантність до глюкози підтвердив, що годування з високим вмістом жиру або постнатальне програмування викликали непереносимість глюкози, резистентність до інсуліну та дисліпідемію. Дійсно, AUC для глюкози, інсуліну та циркулюючих FFA у плазми крові збільшилася у щурів CHF та PLF порівняно з такою у щурів CLF. AUC для глюкози у плазмі та FFA були порівнянними у тварин із ХСН та ФЛП, тоді як AUC для інсуліну у плазмі крові була більшою у ХСН порівняно з такою у щурів PLF. Коли запрограмованих щурів годували дієтою з високим вмістом жиру, AUC для вмісту глюкози в плазмі, інсуліну та плазмових кислот у плазмі крові ще більше збільшували.

Постнатальне програмування мало протилежний вплив на рівень мРНК 11β-HSD-1 та GR. Порівняно з щурами CLF, тварини PLF демонстрували підвищений рівень мРНК GR та зниження концентрації 11β-HSD-1 мРНК. Дієта з високим вмістом жиру знизила рівень мРНК 11β-HSD-1 печінки у контрольних та запрограмованих щурів, тоді як значення рівня мРНК печінки значно зменшились лише у запрограмованих тварин. Концентрації мРНК PEPCK були порівнянними між усіма групами. На концентрації мРНК PAI-1 в печінці не впливали ні постнатальне програмування, ні дієта з високим вмістом жиру, але продемонстрували значне збільшення, коли обидва способи лікування були пов’язані (рис. 2).

Напівкількісний аналіз мРНК EAT GR (A) та 11β-HSD-1 (C) (ліва панель) та мРНК MAT GR (B) та 11β-HSD-1 (D) (права панель) у контрольних або запрограмованих щурів, яких годували низько- жирна (□) або жирна (▪) дієта (n = 10, 10, 9 та 12 відповідно). Дані є середніми ± SE. Статистичний аналіз проводили за допомогою двостороннього аналізу ANOVA з подальшим тестом Фішера post hoc. * Р 0,05 проти дієти з низьким вмістом жиру) або у тварин, запрограмованих після пологів (5,0 ± 0,5 та 6,3 ± 0,6 нКі/г відповідно в ЕАТ або МАТ; Р> 0,05 проти дієти з низьким вмістом жиру).

Постнатальне програмування та дієта з високим вмістом жиру сприяють зменшенню циркулюючого адипонектину.

Порівняно з концентрацією контрольних тварин, концентрація адипонектину в циркуляції знижувалася за допомогою постнатального програмування або дієти з високим вмістом жиру. Двосторонній аналіз ANOVA показав, що існувала значна взаємодія (F = 5,30, P = 0,0262) між постнатальним програмуванням та дієтою з високим вмістом жиру при зниженні адипонектину в плазмі крові. У системі EAT, але не MAT, годування з високим вмістом жиру або постнатальне програмування знижували рівень мРНК адипонектину, причому цей ефект більш помітний у тварин з PHF (рис. 5).

Напівкількісний аналіз мРНК MAT TNF-α (A), TNF-R1 (B), IL-6 (C), резистину (D) та PAI-1 (E) у контрольних або запрограмованих щурів, яких годували з низьким вмістом жиру (□) або дієта з високим вмістом жиру (▪) (n = 10, 10, 9 та 12 відповідно). Дані є середніми ± SE. Статистичний аналіз проводили за допомогою двостороннього аналізу ANOVA з подальшим тестом Фішера post hoc. * P Переглянути цю таблицю:

Переглянути вбудований
Переглянути спливаюче вікно

Корелати MAT 11β-HSD-1

ОБГОВОРЕННЯ

Нарешті, наші дані демонструють, що екологічні та/або харчові норми місцевого метаболізму глюкокортикоїдів є тканинними. Ми виявили, що годування з високим вмістом жиру регулює рівень печінки GR та експресію 11β-HSD-1, як описано раніше (14), незалежно від постнатального програмування. Такі зміни можуть представляти собою адаптивний механізм протидії метаболічним захворюванням, що проілюстровано відсутністю змін рівнів мРНК PEPCK в печінці в умовах посиленого постнатального програмування або індукованого кортикостероном дієти з високим вмістом жиру. Можуть бути задіяні відмінності в активності білків CCAAT/зв'язуючих енхансер (C/EBP), необхідних для диференціації та дозрівання адипоцитів, між печінкою та жировою тканиною. Було показано, що в печінці C/EBPα є потужним активатором гена 11β-HSD-1, тоді як C/EBPβ діє як домінантний репресор С-EBPα-стимульованої активності 11β-HSD-1 (46). І навпаки, хоча як C/EBPα, так і -β необхідні для базальної транскрипційної активності 11β-HSD-1 у 3T3-L1, клітинній лінії преадипоцитів, C/EBPβ активно бере участь у стимуляції форсколіном 11β-HSD-1 транскрипція генів (47). Цікаво, що нещодавно було продемонстровано, що миші з делецією гена C/EBPβ захищені від ожиріння, спричиненого дієтою (48).

На закінчення, наші дані вперше показують, що маніпуляції з навколишнім середовищем, такі як постнатальне перегодовування, програмують підвищений рівень жирової дієти, регуляцію експозиції глюкокортикоїдів MAT, чутливості та запального стану, а отже, виявляють ключову роль навколишнього середовища під час перинатальний період на розвиток порушення регуляції жирової тканини в дорослому віці. Дані також вимагають клінічних випробувань із застосуванням специфічних інгібіторів 11β-HSD-1.

Подяки

Ми дякуємо професору А. Окіє та д-ру А. Ланду (відділ клінічних досліджень, AP-HM, Марсель, Франція) за допомогу у статистичному аналізі.