Парадоксальний захисний ефект перфтооктансульфонової кислоти проти індукованого стеатозом печінки жиру з високим вмістом жиру у мишей

Анотація

Вступ

Перфторактанова сульфонова кислота (ПФОС) належить до класу хімічних речовин, відомих як перфторалкильні кислоти. Ці гідрофобні та ліпофобні сполуки використовуються в різних побутових та промислових застосуваннях завдяки своїм термо- та хімічно стабільним властивостям [1]. PFOS присутній у 99,9% зразків сироватки людини в США із середньою геометричною концентрацією в сироватці 20,7 мкг/л [2]. PFOS можна знайти в організмі людини та дикої природи у всьому світі [3] PFOS зазнає біоакумуляції в організмі людини через тривалий період напіввиведення в сироватці крові 4,7 року [4]. PFOS поширюється головним чином у печінці дорослих гризунів та плодів, що зазнали внутрішньоутробного розвитку [5], де він індукує печінковий стеатоз, гепатомегалію та печінковий канцерогенез [6–8].

Безалкогольна жирова хвороба печінки (НАЖХП) в даний час є основним розладом печінки з поширеністю понад 25% серед загальної популяції і є в усьому світі, включаючи США [9]. Пацієнти з НАЖХП мають більш високий ризик прогресування до більш важких форм захворювань печінки, таких як НАСГ, фіброз, цироз, що в кінцевому підсумку призводить до ВГС, яка є другою за частотою причиною смертності від раку [10, 11]. НАЖХП є основним печінковим проявом метаболічного синдрому, який є сукупністю симптомів, включаючи ожиріння, цукровий діабет та дисліпідемію [12]. Нещодавно асоційована з токсичними жирами хвороба печінки (TAFLD) була визначена як жирова хвороба печінки, пов’язана з хімічним впливом [13]. Цілком ймовірно, що PFOS є збудником TAFLD, враховуючи його здатність індукувати стеатоз печінки та всюдисущу присутність у зразках сироватки людини з потенціалом біоакумуляції.

У цьому дослідженні ми використовували експериментальну модель НАЖХП, індуковану дієтичним годуванням з високим вмістом жиру, щоб перевірити здатність експозиції ПФОС, що відповідає людині, посилювати формування жирової хвороби печінки. На відміну від нашої гіпотези, ми спостерігали захисний ефект проти НАЖХП, індукованого ВЧЧ, коли ПФОС вводили одночасно з ВЧЧ. Ми досліджували експресію метаболічних генів та регуляторів, щоб дослідити потенційні механізми захисту. Наші висновки виявляють токсичність ПФОС, яка залежить від дієти, та надають докази його горметичного впливу на розвиток печінкового стеатозу.

Матеріали та методи

Догляд за тваринами та підготовка тканин

Усі дослідження на тваринах були схвалені та проведені відповідно до Інституційного комітету з догляду та використання тварин (IACUC) при Медичному центрі Університету Канзасу. Восьмитижневі самці мишей C57BL/6J, придбані у лабораторії Джексона (Бар-Харбор, штат Мексика), отримали вільний доступ до будь-якої нормальної дієти чау (ND) (73% ккал вуглеводів, 11% ккал жиру, 16% ккал білка) (Спеціальна дієта для тварин, AD2001)) або дієта з високим вмістом жиру (HFD) (24,8% ккал вуглеводів, 59,2% ккал жиру, 15% ккал білка) (Дієта тварин, AD2002) з і без 0,0001% (1 мг/кг) перфтороктансульфонової кислоти (PFOS) (Sigma Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі) протягом шести тижнів. Мишей з кожної когорти обробки (n = 5) утримували в групі в контрольованих температурою умовах (23 ° C) з 10-годинним темним/14-годинним світловим циклом. Стратегія дозування була обрана шляхом екстраполяції дози, використаної в попередньому звіті, коли мишей годували дієтою, що містить 0,001% PFOS, що призвело до концентрації PFOS у сироватці 102 мкМ [14]. Крім того, концентрація PFOS у сироватці крові становить 11 мкг/мл (

23 мкМ) було досягнуто шляхом годування 0,0001% PFOS, що містить дієту, протягом 28 днів [15]. Таким чином, очікувалось, що доза, використана в цьому дослідженні, досягає концентрації в сироватці близько 10 мкМ, що, опублікований раніше огляд літератури, припускає, що вона порівнянна з професійним рівнем впливу [16]. Для приготування дієти, використаної у цьому дослідженні, ПФОС розчиняли у воді та ретельно змішували у попередньо зважені порошкоподібні ND або HFD до кінцевої концентрації 1 мг/кг (0,0001%). Дієти залишали сушитися на ніч, а гранули формували наступного дня. Неочищені порошкоподібні дієти також змішували з водою і формували в гранули, щоб забезпечити консистенцію годування. Печінку та жирову тканину збирали, зважували та швидко заморожували у рідкому азоті під час евтаназії. Глюкозу в крові вимірювали за допомогою глюкометра, використовуючи кров, зібрану через ретроорбітальну пазуху під час евтаназії.

Гістологія та імуногістохімія

Парафінові зрізи печінки мишей фарбували на гематоксилін та еозин (H&E) та спостерігали під світловим мікроскопом. Парафінові зрізи печінки мишей фарбували на проліферуючий клітинний ядерний антиген (PCNA), як описано раніше [17]. Свіжозаморожені зрізи печінки використовували для визначення вмісту ліпідів у печінці шляхом фарбування Олійним Червоним O, як описано раніше [18].

Виділення білка та аналіз вестерн-блот

Виділення білка та Вестерн-блот-аналіз проводили, як описано раніше [16]. Первинне антитіло, що використовується для виявлення проліферуючого клітинного ядерного антигену (PCNA), було придбано у Cell Signaling Technology (Cat. # 2586, Danvers, MA).

Виділення та кількісне визначення тригліцеридів печінки

Загальні печінкові тригліцериди (ТГ) виділяли із замороженої печінки за протоколом перетравлення КОН, як описано раніше [19]. Кількісне визначення ізольованих TG проводили за допомогою набору реагентів тригліцеридів (GPO) (Pointe Scientific, Каталог # T7532-500) і розраховували порівнянням зі стандартною кривою відомих концентрацій TG із використанням стандартного реагенту тригліцеридів (Pointe Scientific, Каталог # T7531-STD ) згідно з протоколом виробника. Вміст TG, виміряний у кожній пробі, нормалізувався на вагу печінки, яка використовувалася для ізоляції TG.

Кількісне визначення ліпідів у сироватці крові

Сироватку готували з центрифугування свіжої крові при 5000 об/хв протягом 10 хвилин. Тригліцерид сироватки крові вимірювали за допомогою набору реактивів тригліцеридів (GPO) (Pointe Scientific, Каталог # T7532-500) і розраховували порівнянням зі стандартною кривою відомих концентрацій TG із використанням стандартного реагенту Triglcyeride (Pointe Scientific, Каталог # T7531-STD) відповідно згідно з протоколом виробника. Концентрацію холестерину в сироватці крові вимірювали за допомогою набору холестеринових реагентів (Pointe Scientific, Каталог # C7510) і обчислювали порівнянням із стандартною кривою відомої концентрації холестерину за допомогою стандартного Reagenet холестерину (Pointe Scientific, Каталог # C7509-STD) згідно з протоколом виробника.

ПЛР у реальному часі

Виділення РНК, перетворення в кДНК та аналіз ПЛР у реальному часі (RT-PCR) проводили, як описано раніше, без змін [20]. Зміна експресії у складі порівняно з контрольною дієтою, яка отримувала необроблену групу, визначали за допомогою методу ddCt [21], при цьому 18 років використовували як контрольний ген ведення домашнього господарства. Послідовності праймерів для генів, що цікавлять, наведені в таблиці 1 .

Таблиця 1

Послідовності праймерів, використані в цьому дослідженні

GeneForward Primer (5′ – 3 ′) Reverse Primer (5′ – 3 ′)

апоальний	TGTGTCCCAGTTTGAATCCTC	GTTATCCCAGAAGTCCCGAG
апоа2	GACACCCCTTGTCAGGTCAG	TGGCACATCTCACTTAGCCG
апоб	CTGCAACCAAGCTGGCATAAG	CCTCCATCCTGAGTTGGACA
mttp	CAAGCTCACGTACTCCACTGAAG	TCATCATCACCATCAGGATTCCT
cd36	ATGGGCTGTGATCGGAACTG	GTCTTCCCAATAAGCATGTCTCC
пепк	TGCGGATCATGACTCGGATG	AGGCCCAGTTGTTGACCAAA
g6pc	CCGGTGTTTGAACGTCATCT	CAATGCCTGACAAGACTCCA
pparg	CCACAGTTGATTTCTCCAGCATTTC	CAGGTTCTACTTTGATCGCACTTTG
ппара	ACAAGGCCTCAGGGTACCA	GCCGAAAGAAGCCCTTACAG
srebf1	GGGCAAGTACACAGGAGGAC	AGATCTCTGCCAGTGTTGCC
ces3	TGTATGAGTTTGAGTATCGCCC	CATCTTGCTGAGGTTGGTCT

Статистичний аналіз

Усі гістограми відображають середнє значення ± SEM. Для перевірки нормальності розподілу було проведено тест Шапіро-Вілка, а для перевірки однорідності дисперсії - тест Левена. Усі дані відповідали цим вимогам. Були проведені багаторазові порівняння з використанням одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) з подальшим пост-hoc аналізом Дункана з p Рис. 1A). На підставі даних про масу тіла та споживання їжі ми підрахували, що миші, які годували ND + PFOS, отримували дозу 0,089 мг/кг/день, а миші, які годували HFD + PFOS, отримували дозу 0,087 мг/кг/день. Статистичної різниці в дозі, отриманій між цими групами, не було (таблиця 2). На малюнку 1В детально розказано про різницю в масі тіла, яка склалася між групами під час дослідження. На 0-й день суттєвих відмінностей у масі тіла між групами не існувало. На 4-й день групи, що отримували HFD, були значно важчими, ніж миші ND + NT, але не важче, ніж миші ND + PFOS. У 18 та 35 дні групи, що харчувались HFD, були значно важчими, ніж групи, які харчувались ND. До 42-го дня, хоча миші HFD + NT були значно важчими, ніж групи, які годувались ND, лікування PFOS збільшувало вагу у мишей, що годувались ND, і зменшувало вагу у мишей, що годували HFD, що не призводило до значної різниці між мишами, які отримували ND + PFOS та HFD + Щоб визначити причину відмінностей у масі тіла, ми визначили ожиріння зважуванням епідидимальних жирових прокладок (рис. 1С). Миші, яких годували HFD, показали значне збільшення маси жиру епідидиму, як очікувалося. Однак, хоча лікування PFOS збільшувало епідидимальну жирову масу у мишей, яких годували ND, лікування PFOS не посилювало накопичення маси жиру епідидимального у мишей, що годували HFD.