Оксалат індукує епітеліальний перехід II типу до мезенхімального переходу (ЕМТ) у клітинах внутрішнього медулярного збірного протоку (IMCD) в пробірці і стимулювати експресію остеогенних та фіброзних маркерів у довгастому мозку в природних умовах

Метрики: PDF 1284 переглядів | Повний текст 1058 переглядів | ?

Марсія Конвенто, Едсон Пессоа, Алеф Араган, Нестор Шор та Фернанда Борхес

Анотація

Марсія Конвенто 1, Едсон Пессоа 1, Алеф Араган 2, Нестор Шор 1 і Фернанда Борхес 1, 2

1 Нефрологічний відділ, Медичний факультет, Федеральний університет Сан-Паулу, Сан-Паулу, Бразилія

2 Міждисциплінарна програма післядипломної освіти з медичних наук, Університет Крузейро-ду-Сул, Сан-Паулу, Іспанія, Бразилія

Ключові слова: перехід епітелію в мезенхіму; остеогенна диференціація; оксалат; TGF-β1; нирковий мозок

Отримано: 25 липня 2018 р. Прийнято: 12 січня 2019 р. Опубліковано: 01 лютого 2019 р

ВСТУП

Оксалат (Ox) є звичайним побічним продуктом метаболізму, і невеликі утворені кількості, як правило, нешкідливо виводяться з сечею. Тим не менше, посилена екскреція оксалату (Ox) із сечею внаслідок генетичної (первинна гіпероксалурія) та факторів зовнішнього середовища (ідіопатична гіпероксалурія), прийому їжі, багатої оксалатами (вторинна гіпероксалурія), мальабсорбції жиру внаслідок шунтування шлункової залози та сучасного шлункового шунтування ( кишкова гіпероксалурія) [1, 2] може призвести до сечокам’яної хвороби, нефрокальцинозу, пієлонефриту, гідронефрозу, фіброзу та ниркової недостатності [3, 4].

Для дослідження гіпероксалурії та її наслідків були розроблені різноманітні моделі тварин. На індукованій етиленгліколем [5] та HPL [3] гіпероксалурії на тваринах моделі було виявлено серйозне пошкодження тубулоінтерстиціальної області. Ці ураження характеризувались некрозом канальцевих епітеліальних клітин, відкладеннями кристалів оксалату кальцію в просвітах канальців та запальними інфільтратами, перекисним окисленням ліпідів та проліферацією резидентних інтерстиціальних клітин, таких як фібробласти, а також збільшенням елементів позаклітинного матриксу, включаючи волокна колагенів [1, 6–8].

Показано, що оксалат токсичний для клітин ниркового епітелію коркового походження [9–13]. Однак клітини внутрішнього медулярного збірного протоку (IMCD), які фізіологічно піддаються дії більш високих концентрацій оксалату, можуть поводитися по-різному. Ці клітини виживають в унікальному середовищі в організмі, часто підданому дії смертельних екстремальних значень осмоляльності, рН та токсинів. Мароні та ін. [14], продемонстрували, що проксимальні канальцеві клітини свиней (LLC-PK1) та проксимальні канальцеві клітини нирок людини (HK-2) зазнали значних травм при менших концентраціях оксалату натрію порівняно з клітинами IMCD. Крім того, Брейді та ін. [15], припустили, що клітини HK-2 є більш чутливими, ніж клітини IMCD, до цитотоксичності цисплатину в пробірці, підтверджуючи думку про те, що клітини IMCD відносно більш стійкі до токсичності. Тим не менше, клітини IMCD можуть не бути інертними до оксалатних ефектів і можуть брати участь у нефролітіазі через переходи фенотипу та остеогенні набуваючі характеристики, як нещодавно було показано у гіпероксалуричних мишей в природних умовах [16].

Інше дослідження нашої групи продемонструвало, що вплив оксалатних іонів на проксимальні канальцеві епітеліальні клітини людини (HK-2) стимулює епітеліальний перехід типу 2 до мезенхімального переходу (ЕМТ) [17].

ЕМТ типу 1 виникає під час нормального органогенезу. ЕМТ 2 типу пов’язаний із загоєнням ран, регенерацією тканин та фіброзом органів. ЕМТ типу 3 пов’язаний з новоутвореними клітинами, які можуть мігрувати в навколишні тканини та інвазувати в місцях метастазування [18–20].

ЕМТ типу 2 є важливим проявом пластичності епітеліальних клітин під час регенерації тканин та фіброзу органів, він пов'язаний з реакціями відновлення тканин, такими як фіброз, на основні пошкодження органів. При нирковому фіброзі, якщо пошкодження є легким та гострим, процес загоєння розглядається як репаративний фіброз; навпаки, при триваючому хронічному запаленні аномальне утворення міофібробластів, що характеризується підвищеною моторикою, синтезом білка позаклітинного матриксу, проліферацією та інвазивністю [18–20].

Втрати експресії маркерів епітеліальних клітин відбуваються одночасно з цими змінами та як їх рушій. Архітектура та перманентність епітеліальних клітин при ущільненні щільних з’єднань залежать від контактів клітин-клітин, що містять Е-кадгерин. Окрім підтримки адгезії клітинних клітин, кадгерини можуть впливати на широкий спектр клітинних функцій, які включають активацію клітинних сигнальних шляхів, регуляцію цитоскелета та контроль полярності клітин [18–20].

Трансдиференційовані епітеліальні клітини втрачають певні контакти мембрани клітин-базал, а свою структурно-функціональну полярність стають веретеноподібними та морфологічно схожими на активовані фібробласти. Існують мезенхімальні маркери, виражені в EMT типу 2, як α-SMA, який вважається мікрофіламентом. маркер міофібробласту. Іншим показаним мезенхімальним маркером є Vimentin, проміжна нитка, експресія якої безпосередньо пов’язана із клітинними фенотиповими змінами [18–20].

Вважається, що ЕМТ типу 2 виникає у відповідь на деякий стресовий стимул навколишнього середовища, як механічне розтягування [21], токсичність при обробці циклоспорином [22], вплив прогресивних кінцевих продуктів глікування (AGE-наслідок гіперглікемії) [23] та окислювальний стрес [ 24].

Показано, що деякі розчинні фактори росту, цитокіни та позаклітинні білки впливають на ЕМТ 2 типу та впливають на прогресування ниркової хвороби. Однак трансформуючий фактор росту бета (TGF-β1), мабуть, відіграє помітну роль, при цьому рівень експресії майже повсюдно зростає при прогресуючих формах ниркової хвороби [25, 26]. Насправді TGF-β1 може індукувати генетичну програму пластичності клітин, що включає ключові шляхи та регулятори дедіференціації епітелію, реорганізації цитоскелета та проліферації. TGF-β1 індукує експресію фіброзних генів і опосередковує апоптоз клубочкових та канальцевих клітин, механізм, за допомогою якого клітини канальцевих епітеліїв можуть набувати міофібробластичний фенотип, необхідний для патогенезу фіброзу [27–29].

EMT типу 2 вже продемонстровано в клітинах IMCD в пробірці, через вплив рецепторами епідермального фактора росту [30], бестрофіном-1 [31], TGF-β1 [32], інсуліноподібними факторами росту [32] та фактором диференціації росту-11 [27]. В природних умовах експерименти показали, що вроджена обструкція сечовивідних шляхів у людей [33] та тварин [34] при пошкодженні епітеліальних клітин колекторної протоки та ЕМТ типу 2. Однак індукція оксалатів ЕМТ типу 2 у медулярний збірний проток, яка походить не від мезенхімальної метанефричної, а від бруньки сечоводу, не була продемонстрована.

Гіпероксалуричні щури збільшували мезенхімальні маркери та гени остеогенних маркерів як у корі нирки, так і в мозковій речовині [16]. Таким чином, це дослідження припускає, що оксалатні іони можуть індукувати ТЕМ типу 2 в клітинах IMCD і що ці трансформовані клітини можуть стимулюватися для експресії остеогенних маркерів в пробірці. Ефекти оксалату в природних умовах на нирковому мозку мишей також буде оцінено.

РЕЗУЛЬТАТИ

Щоб визначити, чи стали клітини IMCD, піддані дії Ox та TGF-β1, більш активними в інвазії, ніж контрольні клітини, ми оцінили цю характеристику мезенхімальних клітин за допомогою аналізу в камері трансульви.

Як показано на малюнку 1А, клітини IMCD, що зазнали дії Ox 0,5 мМ (0,246 ± 0,003 DO) та TGF-β1 20 нг/мл (0,285 ± 0,006 DO), потрапляли через пори швидше, ніж контрольні клітини (0,132 ± 0,005 DO). Набуття здатності клітинної інвазії є характеристикою ТЕМ типу 2. Група Ox (0,5 мМ) набуває цієї здатності, а також стимульована TGF-β1 група (позитивний контроль), яка вважається головним посередником ТЕМ типу 2 [35, 36]. Беручи це до уваги, ці групи залишились у нашій моделі дослідження.

Приготування оксалатних іонів

Розчини оксалату дикалію (0,4 М, 100 мл) (Merck, Дармштадт, Німеччина) додавали до 300 мл дистильованої деіонізованої води при постійній швидкості крапель 1 мл/хв протягом 2 год. Цю суспензію безперервно перемішували протягом 5 год при 75 ° С, а потім промивали деіонізованою водою для видалення хлористого калію. Оксалат (10 мМ) додавали до забуференного фосфатом сольового розчину (кальцію, що не містить PBS), стерилізували у фільтрі 0,22 мкМ і використовували у відповідних протоколах при концентрації 0,5 мМ (48 год). На додатковому малюнку 1 клітини піддавали впливу 1,0 Мм (48 год), однак у нашому дослідженні не використовували.

Вплив IMCD імморталізованих клітин оксалат-іонами (0,5 мМ), екзогенним TGF-β1 (20 нг/мл) і NAC (10 мМ)

Перед експериментами імморталізовані клітини (колекція американських культур культур (ATCC)) витримували в умовах культивування протягом 2 днів. На місці злиття IMCD протягом 48 годин піддавали дії або DMEM (5% FBS, контроль), DMEM, що містить оксалат (0,5 мМ), TGF-β1 (20 нг/мл, Peprotech, NJ, США), використовуваний як позитивний контроль типу 2 ТЕМ та N-ацетилцистеїн (10 мм, Sigma, Сент-Луїс, Міссурі, США). Експериментальний протокол повторювали принаймні 3 рази в різні періоди. N = 5 для кожної групи.

Аналіз вторгнення

Вторгнення IMCD аналізували за допомогою аналізу через лунки; 10 5 клітин додавали до верхніх камер 6-лункових трансплантаційних планшетів (розміром 8 мкм, Millipore Corporation, Bilerica, MA, США) і середовища, що містять 5% FBS з Ox і TGF-β1, додавали до нижніх камер для 48 год. Верхні (неінвазивні) клітини видаляли, нижні (інвазивні) клітини фіксували у формальдегіді 3,7%, фарбували трипановим синім, розчиняли в додецилсульфаті натрію (2%) та реєстрували поглинання при 620 нм. Всі ці аналізи проводились у трьох примірниках.

Імунофлюоресценція

Клітини IMCD вирощували на предметних предметних стеклах Labtek II з 8 лунками, потім промивали PBS, фіксували (3,7% свіжого параформальдегіду в PBS протягом 20 хвилин при кімнатній температурі), проникали (0,5% Triton X-100 протягом 5 хвилин), блокували 5 % сольового розчину, забуференного альбуміном/фосфатом (BSA/PBS), протягом 60 хв. Після блокування первинні моноклональні антитіла щурів (Санта-Крус). 1:50 до Е-кадгерину, α-SMA та Віментин додавали протягом ночі при 4 o C у 0,5% BSA/PBS. Помічені FITC вторинні анти-щурячі IgG та IgG проти мишей (1: 100) (Санта-Крус) додавали протягом 2 годин при кімнатній температурі в 0,5% BSA/PBS і клітини інкубували з DAPI (4′6-діамідино- 2-феніліндол, Sigma) 10 мкг/мл. Покривні шафи встановлювали на предметних стеклах із забуференним гліцерином та аналізували за допомогою флуоресцентної мікроскопії Nikon. Отримані мікроскопічні зображення кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення ImageJ. Дані подаються як відсоток позитивно інтенсивності флуоресценції на площу [62].

Аналіз міграції

Аналіз загоєння ран зазвичай використовують для оцінки ефекту про- та антиміграційних агентів на культивовані клітини [63]. Коротко кажучи, клітини вирощували до місця злиття в пластикових посудах для культури до щільності приблизно 5 × 10 6 клітин/лунка. Через 24 години спокою клітини оголили, перетягнувши гумового поліцейського через центр тарілки. Культури промивали PBS і замінювали свіжим середовищем, що містить 5% FBS (контрольна ситуація), а середовище, що містить 5% FBS, додавало Ox (0,5 мМ) і TGF-β1 (20 нг/мл), після чого клітини IMCD інкубували при 37 ° С протягом 48 год і сфотографовано.

Ланцюгова реакція полімерази в режимі реального часу (ПЛР у реальному часі)

Загальну рибонуклеїнову кислоту (РНК) очищали (клітини IMCD та мозкову нирку мишей) методом фенолу та гуанідину ізотіоціанат-цезію хлоридом, використовуючи відповідний набір (Trizol, Life Technologies, США). 2 мікрограми загальної РНК обробляли ДНКазою (RQ1 ДНКаза без РНКази, Промега) для запобігання забрудненню геномної дезоксирибонуклеїнової кислоти. Гранулу РНК ресуспендували у воді без РНК-ази. Зворотна транскрипція в кДНК додаванням суміші, що містить 0,5 мг/мл оліго d (T), 10 мМ DTT, 0,5 мМ dNTP (Pharmacia Biotech) та 200 U ферменту зворотної транскриптази (SuperScript RT, Gibco-BRL). Ампліфікацію в реальному часі отримували за допомогою системи виявлення послідовності GeneAmp 7700 (SDS, ABI Prism 7700, Applied Biosystems) та контролювали за допомогою інтеркалюючого барвника SYBR Green I (Applied Biosystems). ПЛР проводили із селективними праймерами (додаткова таблиця 1). Результати повідомляли як відносну експресію, нормалізовану за геном ведення домашнього господарства β-актину. Варіацію згину визначали методом 2- (ΔΔCt) згідно з раніше опублікованим протоколом [64].

Аналіз остеоіндукції

Клітини IMCD експонували протягом 48 годин або DMEM (5% FBS, контроль), DMEM, що містить оксалат (0,5 мМ), і TGF-β1 (20 нг/мл). Після цього періоду клітини виставляли в остеогенному кондиціонованому середовищі, включаючи α-MEM з 5% FBS, 50 мкг/мл аскорбінової кислоти (Gibco), 10 мМ b-гліцерол-фосфату (Gibco) та 10 нМ дексаметазону (Sigma), протягом 15 днів посів із щоденною зміною остеогенного кондиціонованого середовища. Загальну РНК (ПЛР у реальному часі) екстрагували для виявлення експресії остеогенних маркерів, пов'язаних з рунтом транскрипційного фактора 2 (RUNX-2) та лужної фосфатази (ALP). На 15 день додавали позаклітинний матриксний барвник (Alizarin Red S) на планшети в культурі, і зображення фотографували у всіх групах.

В пробірці аналіз перекисного окислення (речовини, що реагують на тіобарбітурову кислоту - TBARS)

Малопандіальдегід (MDA) поєднується з тіобарбітуровою кислотою (TBA), утворюючи червону сполуку, концентрацію якої оцінювали за допомогою спектрофотометрії з показниками при 535 нм [65]. Культуральне середовище без фенолу та клітинних гомогенатних зразків клітинних культур стимулювали оксалатом (0,5 мМ) і TGF-β1 (20 нг/мл) у відсутність та присутність NAC (10 мМ) протягом 48 год. Добавка NAC забезпечує сульфтіолову групу L-цистеїну, а також надає антиоксидантну дію, безпосередньо відсмоктуючи вільні радикали. Клітинні гомогенати отримували шляхом зрізання клітин із колб з PBS. Зразки додавали до розчину 0,375% TBA, 15% трихлороцтової кислоти та 0,25 HCl (Sigma Chemicals), витримували при постійному перемішуванні, нагрівали при 95 ° C протягом 20 хв і згодом охолоджували до кімнатної температури. Концентрацію білка перевіряли методом Лоурі [66]. Позитивний контроль був отриманий шляхом інкубації зразків клітин з H2O2 при 1% протягом 1 години перед аналізом. Результати коригували за допомогою білка і виражали у мкМ/мг.

Вестерн-блот

Концентрацію білка перевіряли методом Лоурі [66]. Клітини IMCD лізували 200 мкл ліпного буфера RIPA на пластину (100 мм 2). Лізати центрифугували при 12000 g протягом 5 хв при 4 ° C, а супернатанти зберігали при -80 ° C. Білки (30 мкг) відокремлювали електрофорезом у 10% поліакриламідному гелі та переносили їх у мембрани з фторидом полівінілідену, використовуючи електротрансферну клітинку Mini Trans-Blot (BioRad). Неспецифічні сайти зв'язування блокували 5% BSA (об/об) у буфері TBS. Імуноблоти інкубували протягом ночі при 4 ° С з первинними антитілами TGF-β1 та GAPDH (1: 1000, Санта Круз Біотехнологія, Даллас, Техас, США). Після триразового промивання TBS-T мембрани інкубували протягом 1 години при 4 ° C у кон'югованих з HRP вторинних антитілах (1: 30000; клітинна сигналізація). Імунореактивні білкові смуги візуалізували з використанням хемілюмінесцентного субстрату Pierce ECL Plus, що виявляє реагенти (Thermo Fisher, США). Зображення отримували та аналізували за допомогою системи документації з хемілюмінесценції Alliance 7 (UVItec, Кембридж, Великобританія). Інтенсивності смуг імуноблотів визначали кількісно за допомогою програмного забезпечення ImageJ і виражали як співвідношення TGF-β1/GAPDH.

В природних умовах експериментальні групи

Експериментальний протокол був затверджений Комітетом з етики Федерального університету Сан-Паулу (номер протоколу CEP 1098/10), також узгоджуючись із бразильськими рекомендаціями щодо наукового догляду та використання тварин [67, 68]. Мишей C57Bl/6 поділяли на такі групи: контрольна група, яка отримувала воду ad libitum протягом 60 днів; група HPL, яка отримувала 5% HPL протягом 60 днів ad libitum. По закінченні експериментального протоколу через 60 днів мишей витримували протягом 24 годин у метаболічних клітинах для збору сечі, а потім жертвували, використовуючи токсичну дозу анестетика (кетамін та ксилазин). Нирки видалили для гістологічного аналізу. Об’єм сечі вимірювали для аналізу виведення оксалатів. Експериментальний протокол повторювали 3 рази в різні моменти з N = 5 для кожної групи.

Оксалат сечі

Аналізували за допомогою набору оксалатоксидази (Trinity Biotech, Co. Wicklow, Ірландія) відповідно до протоколу виробника. Результати коригували через об’єм сечі та виражали у ммоль/24 год.

Кристали сечі

Осад сечі отримували центрифугуванням (2300 об/хв протягом 5 хвилин) і підраховували в камері Нойбауера за формулою: (кінцевий об’єм × кількість де кристалів)/(початковий об’єм × 0,0001) та фотографували. Результати виражали як сечові кристали/мл.

Гістохімічний аналіз

Парафінові зрізи піддавали розтвору градієнта ксилолу та спирту, відновленню антигену, блокуванню білка та інкубації з первинним кролячим анти-TGF-β1 (1: 100, Санта-Крус, США) протягом ночі при 4 ° C. Після цього періоди зрізи інкубували з полімером декстрану, кон’югованим з пероксидазним антитілом, протягом 30 хвилин (набір DAKO Envision, Dako, Данія). Маркування виявляли шляхом оголення зрізів з використанням хромогенного субстрату. Первинне антитіло опускали як негативний контроль, а зрізи фарбували гематоксиліном та аналізували під світловим мікроскопом модель Olympus BX 60 при збільшенні 20x або 40x. Парафіновий зріз нирки також фарбували пікросіріусовим червоним і кількісно визначали під мікроскопом із поляризованим світлом (Olympus BX 60), щоб оцінити вироблення типів колагену (тип I від жовтого до червоного тону та тип III зеленуватого тону). Отримані мікроскопічні зображення кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення ImageJ і виражали як% забрудненої площі.

Статистичний аналіз

Результати були виражені як середнє значення ± SEM. Статистичний аналіз проводили з використанням одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) з подальшим тестом Тукі пост-хок, стор-значення ->