Мишача модель вертикальної рукавної гастректомії

Дарлайн Гарібей

1 Кафедра біомедичних наук Корнельського університету

Бетані П. Каммінгс

1 Кафедра біомедичних наук Корнельського університету

Анотація

Вступ

Оскільки епідемія ожиріння продовжує зростати у всьому світі, баріатрична хірургія набула популярності, оскільки це найефективніше тривале лікування ожиріння1. На жаль, втрати ваги за допомогою дієти та фізичних вправ важко досягти і відносно неефективний у довгостроковій перспективі2,3. Баріатрична хірургія, така як гастректомія вертикального рукава (VSG), визначається як маніпуляція шлунково-кишкового тракту з метою схуднення1,4. Хоча втрата ваги є важливим результатом баріатричної хірургії, баріатрична хірургія забезпечує інші переваги для здоров'я, такі як покращення супутніх захворювань ожиріння та продовження тривалості життя5. Наприклад, баріатрична хірургія призводить до високих показників ремісії діабету 2 типу та гіпертонії та зменшення ризику розвитку певних видів раку протягом життя1,6,7. Слід зазначити, що ефект баріатричної хірургії, що викликає ремісію діабету 2 типу та гіпертонії, часто спостерігається незабаром після операції та до втрати ваги8,9. Це підкреслює концепцію того, що існують механізми, незалежні від маси тіла, що сприяють досягненню користі для здоров'я після операції. Моделі баріатричної хірургії на тваринах розроблені і використовуються для вивчення механізмів, за допомогою яких відбувається ця користь для здоров'я10,11,12.

Ми перевірили мишачу модель VSG, яку ми застосували до різних генетично модифікованих моделей мишей, щоб вивчити механізми, за допомогою яких баріатрична хірургія покращує супутні захворювання ожиріння, такі як діабет 2 типу, гіпертонія та колоректальний рак10,11,12. Моделі гризунів дозволяють проводити більш експериментальний контроль та можливість проводити генетичні або фармацевтичні маніпуляції для визначення ролі конкретних генів або сигнальних шляхів, що представляють інтерес. Ми зосереджуємось насамперед на VSG, оскільки VSG - це найчастіше виконувана баріатрична процедура в клініці США13. Крім того, VSG - це проста хірургічна модель із меншою кількістю анатомічних модифікацій порівняно з іншими процедурами, такими як шунтування шлунка Roux-en-Y або біліопанкреатична диверсія.

Наша миша модель VSG рекапітулює наступні ефекти баріатричної хірургії, що спостерігаються у людей: втрата ваги, зменшення споживання їжі, поліпшення регуляції глюкози, поліпшення функції острівців, посилена постпрандіальна секреція глюкагоноподібного пептиду-1 (GLP-1), зниження артеріального кров'яний тиск та підвищена концентрація жовчної кислоти в циркуляції 10,11,12,13,14,15. Отже, це ідеальна модель для вивчення незалежних від маси тіла незалежних механізмів, за допомогою яких VSG покращує або усуває супутні захворювання ожиріння. Крім того, це надійна модель, яка може поєднуватися з іншими хірургічними втручаннями, дозволяючи досліджувати вплив VSG при різних станах захворювання з більшим механічним розумінням12.

Протокол

Усі експериментальні протоколи затверджені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Корнельського університету.

1. Дохірургічна підготовка

ПРИМІТКА: Досліджувані миші, як правило, перебувають на тлі ожиріння, спричиненого дієтою C57BL, щоб зробити дослідження поступально актуальними для ожиріння людини та резистентності до інсуліну. Самців і самок мишей можна вивчати, як описано на наступних етапах.

У віці 2 місяців розміщуйте мишей на дієті з 45% або 60% жирів протягом 2 місяців (див Таблиця матеріалів). ПРИМІТКА. Мишей годують жирною дієтою, щоб створити ожиріння та стійкий до інсуліну фенотип. Залежно від цілей дослідження можуть застосовуватися коротші або триваліші періоди дієтичного харчування з високим вмістом жиру.

Продовжуйте годувати мишей ad libitum до операції. Якщо необхідні базові вимірювання, після 7 тижнів дієтичного годування з високим вмістом жиру, швидких мишей протягом 6 год або протягом ночі та беруть вихідну пробу крові для вимірювання метаболітів, що представляють інтерес (наприклад, глюкози).

Продовжуйте мишей дотримуватися дієти з високим вмістом жиру і дайте мишам можливість відновитись протягом тижня після забору крові до фіктивних операцій або VSG. Посадити мишей на рідку дієту (див Таблиця матеріалів) за 4 дні до операції. ПРИМІТКА. Миші дотримуються рідкої дієти до та після операції, щоб очистити травний тракт від твердих частинок, які можуть погіршити реакцію загоєння.

Перед операцією стерилізуйте такі предмети: фольга, марля, аплікатори з бавовняними наконечниками (CTA) та хірургічні інструменти (гемостат, операційні ножиці, ножиці райдужної оболонки, щипці-щипці, зазубрений щипці Брауна-Адсона, голка для сорту, мікроголка, пружинні ножиці).

2. Вертикальна рукавна гастректомія та фіктивні процедури

У день операції зважують мишей, щоб отримати базове вимірювання ваги.

Обладнайте хірургічний кабінет системою анестезії, водяною банею з підігрівом та грілкою. Встановіть на водяній бані 37 ° C і використовуйте для нагрівання 0,9% сольового розчину для зрошення. Очистіть хірургічне поле 70% етанолом і використовуйте стерильну техніку, щоб відкрити автоклавну хірургічну упаковку та інструменти. ПРИМІТКА: Нагрівальна подушка використовується для зігрівання тварини під час операції та відновлення після наркозу.

За допомогою індукційної камери знеболюйте мишу 5% ізофлураном та швидкістю потоку O2 1 л/хв. Переконайтесь, що миша знаходиться у відповідній площині анестезії, виконавши защемлення пальця ноги. Підтримуйте мишу 1-3% ізофлураном та швидкістю потоку O2 0,6 л/хв, як тільки буде досягнута однакова площина анестезії.

Після того, як мишку знеболять, покладіть на очі очну мазь (див. Таблицю матеріалів), щоб зберегти їх вологість під час операції. В цей час також вводять знеболюючий засіб, такий як мелоксикам (2 мг/кг підшкірно). Закріпіть волосся від пупка до пахвової западини, утримуючи шкіру м’яко вниз, щоб забезпечити напругу.

Оскільки шкіра миші тонка і ніжна, подбайте, щоб не викликати ураження шкіри під час стрижки волосся. Очистіть шкіру повідон-йодом та спиртом.

Надіньте стерильні рукавички та підготуйте стерильне хірургічне поле та інструменти. Решту процедур виконайте, використовуючи стерильну техніку. Підготуйте стерильне хірургічне поле, поклавши стерильні хірургічні штори по обидва боки миші. Використовуйте автоклавну олов’яну фольгу, щоб створити хірургічну драпіровку для миші.

Виріжте невеликий отвір у жерстяній фользі, щоб забезпечити доступ до живота миші.

Зробіть розріз шкіри від середини живота (пупка) до рівня мечоподібного хряща за допомогою ірисових ножиць. Визначте linea alba та ножицями райдужки проріжте стінку тіла вздовж linea alba. Використовуйте CTA, щоб м’яко підняти шлунок з живота, а потім тупо розібрати більший сальник від більшої кривизни шлунка.

Лігуйте коротку шлункову артерію, яка проходить між очним дном шлунка та селезінкою, шляхом накладання двох лігатур за допомогою розсмоктуваного шва 7-0 мононитка. Весняними ножицями виріжте між двома лігатурами. Після перерізу артерії повністю екстеріоризуйте шлунок з черевної порожнини. Підкладіть марлю під живіт і змочіть сольовим розчином, щоб тканини були вологими.

Фіктивна процедура

Для підробленої процедури накладіть вільний простий безперервний візерунок шва, використовуючи 6-0 монофіламентний розсмоктуючий шов з конічною голкою. Починають 2 мм праворуч (праворуч від хірурга) стравоходу. Накладіть шовну лінію уздовж вентральної шлункової стінки, а потім продовжуйте вздовж тильної шлункової стінки. ПРИМІТКА. Для всіх шлункових маніпуляцій використовуйте лише монофіламентний розсмоктуючий шов, щоб зменшити ризик зараження. Крім того, використовуйте лише шов з конічною голкою для всіх шлункових маніпуляцій, оскільки використання ріжучої голки збільшує ризик "втягування" шва, що призводить до пошкодження шлункової тканини та зневоднення рани.

Проводячи голку повністю через одну шлункову стінку, одночасно накладаючи шов. Переконайтеся, що шов лежить рівно, але не обмежує шлунок. Акуратно зав'яжіть шов, використовуючи 3-4 кидки, і перейдіть до кроку 2.9.

Для процедури VSG пропустіть крок 2.7 і перейдіть до кроку 2.8.

Процедура VSG

Для процедури VSG лігуйте видатні гілки шлункової артерії та вени за допомогою 7-0 монофіламентного розсмоктуючого шва конічною голкою, використовуючи 3 накиди на кожен вузол. Помістіть лігатури трохи нижче (тобто, до меншої кривизни шлунка) передбачуваної лінії трансекції. ПРИМІТКА: Запланована лінія перетину починається з

На 2 мм вище (мається на увазі більша кривизна шлунка) серцева виїмка шлунка і, принаймні, на 2 мм нижче margo pilcatus і тягнеться до проксимального кінця правої частки підшлункової залози. Зазвичай на стінку шлунка припадає 4 судини, які потрібно перев’язати; однак це може відрізнятися у мишей.

Щоб запобігти розливанню шлункового вмісту під час шлунково-кишкового тракту, покладіть просту безперервну лінію шва, що проходить через обидві шлункові стінки, трохи нижче передбаченої лінії трансекції, використовуючи 6-0 монофіламентний розсмоктуючий шов з конічною голкою. Починайте шовну лінію праворуч від стравоходу хірурга і нижче margo pilcatus і закінчуйте трохи вище підшлункової залози.

Розмістіть гемостати з тонким наконечником над швом і за допомогою пружинних ножиць проріжте між швом і гемостатами. Видаліть перерізану шлункову тканину зі стерильного хірургічного поля. Використовуйте CTA для очищення крові та розщеплення шлунку.

Посилити опору шлункових стінок за допомогою 6-0 монофіламентного розсмоктуючого шва конічною голкою, використовуючи простий розривний малюнок. ПРИМІТКА: Рекомендується простий розривний шовний малюнок, оскільки це забезпечує більш надійне закриття, ніж простий безперервний шовний малюнок.

Промивайте залишок шлунку фізіологічним розчином протягом всієї процедури, щоб тканини були вологими та чистими. Для промивання шлунка фізіологічним розчином використовуйте голку для 20-міліметрового зонду, прикріплену до 20-мл шприца. Використовуйте цей розмір, щоб забезпечити адекватний тиск, не ризикуючи пошкодити шлункову тканину від надмірного тиску або випадкового пошкодження шлункової тканини внаслідок використання звичайної гострої голки.

Використовуйте мінімум 20 вузлів, щоб надійно закрити шлунок; зверніть увагу на закриття вздовж стравохідної сторони, оскільки ця сторона важча для доступу, і тому часто є місцем зникнення.

Переконайтеся, що немає течі, обережно натискаючи на живіт за допомогою CTA. Якщо виявлено витоки, помістіть додаткові прості розривні вузли на ділянки витоку, а потім знову проверіть герметичність. Тест на герметичність, поки не буде виявлено витоку.

Зробіть остаточне ретельне промивання шлунка, використовуючи принаймні 60 мл сольового розчину, щоб переконатися, що позаду не залишилось частинок інфекції.

Помістіть шлунок назад у черевну порожнину під печінку за допомогою CTA. Розмістіть CTA уздовж спинного відділу черевної порожнини, щоб поглинути всю зайву рідину. За допомогою тупої голки 18G вводять лактатний розчин Рінгера (LRS) з антибіотиками або без них (0,5 мл LRS +/- 20 мг/кг енрофлоксацину) безпосередньо в черевну порожнину, безпосередньо перед закриттям. ПРИМІТКА. Це замінює втрату рідини під час хірургічного втручання та забезпечує метод безпосереднього нанесення антибіотиків на місце хірургічного втручання для сприяння відновленню.

Закрийте м’язи черевного шару за допомогою розсмоктувального шва 6-0 мононитками конічною голкою простим розривним малюнком. Потім закрийте шкірний шар простим суцільним малюнком 6-0 монофіламентним розсмоктувальним швом.

Нанесіть тканинний клей на шкіру та складіть шкіру над лінією шва, щоб поховати шов, щоб миша не могла порушити закриття рани після операції.

Вимкніть ізофлуран і дайте миші відновитись на нагрівальній подушці протягом 10-15 хв, перш ніж повернути його у свою домашню клітку. Не залишайте тварину без нагляду, поки вона не прийде до тями і не зможе рухатися.

Утримуйте тварин поодиноко, до повного одужання після операції. ПРИМІТКА: Якщо протягом усього дослідження слід отримувати точні вимірювання споживання їжі, мишей слід продовжувати поодиноко розміщувати протягом дослідження. Існує загроза потрапляння стороннього тіла в їжу постільної білизни в клітці. Тварини повинні міститися в клітках без підстилки, за винятком гніздового матеріалу для збагачення (див Таблиця матеріалів).

3. Післяопераційний догляд та вимірювання миші

Поверніть мишку до домашньої клітки і поставте клітку на грілку. Дотримуйтесь мишей на рідкій дієті принаймні 7 днів після операції. Вводять знеболюючий засіб, такий як мелоксикам (2 мг/кг підшкірно), протягом 2 днів після операції. ПРИМІТКА: Антибіотик, такий як енрофлоксацин (20 мг/кг), може вводитися протягом 7 днів після операції. Антибіотики призначаються, щоб мінімізувати ризик зараження в результаті хірургічної процедури, і вони можуть знадобитися, а можуть і не залежати від рівня стерильності, що підтримується протягом всієї процедури. Однак, якщо використовуються антибіотики, їх потрібно вводити всім мишам в одному і тому ж дослідженні, щоб зберегти консистенцію.

Протягом післяопераційного періоду оцінюйте масу тіла, споживання їжі, дефекацію, рівень активності та розподіл принаймні щодня, щоб забезпечити належне загоєння та відновлення. Проводити післяопераційний моніторинг протягом 14 днів після операції. ПРИМІТКА: Хірургічна недостатність зазвичай спостерігається або відразу після операції, або протягом трьох днів після операції. Тварин, які не їдять і не п’ють на другий день після операції, необхідно ретельно спостерігати на предмет хірургічних ускладнень.

Після успішного завершення післяопераційного періоду регулярно вимірюйте масу тіла та споживання їжі протягом усього дослідження, щоб забезпечити підтримку відповідного фенотипу.

Проведіть пероральний тест на толерантність до глюкози (OGTT), щоб оцінити толерантність до глюкози, стимульовану глюкозою секрецію інсуліну та секрецію гормону кишечника.

Виконайте OGTT у мишей після голодування протягом 6 год, а потім дайте мишам 50% розчину декстрози в дозі 1 г/кг.

Збирайте зразки хвоста крові через 0, 2,5, 5, 15, 30, 60 та 120 хвилин після пробірки. Виміряйте глюкозу в крові за допомогою глюкометра у ці моменти часу. Збирайте зразки сироватки в кожен момент часу для вимірювання різних гормонів, таких як інсулін та GLP-1.

Швидкі миші за 6 год до евтаназії. Візьміть остаточний зразок крові та вимірювання глюкози. Порівняйте остаточне вимірювання глюкози з базовим. Евтаназувати мишей за допомогою внутрішньочеревної ін’єкції пентобарбіталу в дозі 200 мг/кг.

Використовуйте вихідні та кінцеві зразки сироватки для вимірювання додаткових аналітів та порівняння до- та післяопераційних хірургічних показників.

Репрезентативні результати

Підроблені та VSG-процедури зображені на малюнку 1. На малюнку 1А показано, де під час фіктивної процедури накладається шовна лінія вздовж стінок шлунка. У цій самій ділянці розрізається живіт під час операції VSG. На фігурі 1B показаний канальцевий залишок шлунку, що залишився після проведення ВСГ.