Міцний вплив метаболічного синдрому на основні метаболічні шляхи в міокарді

Співпрацювали в цій роботі з: Мар'ям Карімі, Василем Івановичем Павловим

Ролі Концептуалізація, курація даних, формальний аналіз, розслідування, адміністрування проектів, написання - огляд та редагування

Афілійоване відділення хірургії лікарні Род-Айленда, медична школа Уоррена Альперта, Університет Брауна, Провіденс, штат Ріо, Сполучені Штати Америки

Співпрацювали в цій роботі з: Мар'ям Карімі, Василем Івановичем Павловим

Філіал медичної школи Ікана на горі Сінай, Нью-Йорк, Нью-Йорк, Сполучені Штати Америки

Афіліація медичного центру Бет Ізраїль з питань дияконесс, Гарвардська медична школа, Бостон, Массачусетс, Сполучені Штати Америки

Методологія ролей, ресурси

Афіліація Університету Індіани, Медичний факультет, Індіанаполіс, Індіана, Сполучені Штати Америки

Філія Лос-Аламосської національної лабораторії, Лос-Аламос, Нью-Мексико, Сполучені Штати Америки

Ролі Фінансування придбання, нагляд, написання - огляд та редагування

Мар’ям Карімі,
Василь І. Павлов,
Олівія Зіглер,
Ніведіта Шрірам,
Се-Янг Юн,
Вахід Агбортоко,
Стояна Александрова,
Джон Асара,
Френк В. Зелке,
Михайло Стурек

Цифри

Анотація

Цитування: Карімі М, Павлов В.І., Циглер О, Шрірам Н, Юн С-Ю, Агбортоко В. та ін. (2019) Міцний вплив метаболічного синдрому на основні метаболічні шляхи в міокарді. PLoS ONE 14 (12): e0225857. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225857

Редактор: Сезаріо Б'янкі, Університет моги дас Крузес, БРАЗИЛІЯ

Отримано: 21 червня 2019 р .; Прийнято: 13 листопада 2019 р .; Опубліковано: 2 грудня 2019 р

Наявність даних: Дані доступні за номером приєднання PRJNA544355.

Фінансування: NIH (R01HL128831 A.U .; R01HL127072-01A1, HL136347-01 J.F .; P30DK097512 M.S .; Національна лабораторія Лос-Аламоса LDRD 20180060DR) грант B.S.A. У цьому дослідженні використовувались ресурси, надані Національною лабораторною програмою обчислювальних робіт Лос-Аламоса, яка підтримується Міністерством енергетики США Національним управлінням ядерної безпеки за контрактом № DE-AC52-06NA25396.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Скорочення: MetS, метаболічний синдром; LD, контроль пісної дієти; G6P, глюкоза-6-фосфат; F6P, Фруктоза 6-фосфат; AcCoA, ацетил-кофермент А; Пропіоніл КоА, пропіоніл кофермент А; Малоніл КоА, Малоніл Коензим А; FBP1, фруктоза-1,6-бісфосфатаза; G3P, гліцеральдегід 3-фосфат; АТФ, аденозинтрифосфат; G1P, глюкоза 1 фосфат; UDP-GlcNAc, уридиндифосфат N-ацетилглюкозамін; GlcNAc-1P, N-Ac-Глюкозамін-1-фосфат; PGAM1, фосфогліцерат мутаза 1; ENO1, Енолаза 1; GAPDH, гліцеральдегід 3-фосфатдегідрогеназа; CPT1A, карнітин-пальмітоїлтрансфераза 1A; ACAT2, ацетил-КоА ацетилтрансфераза 2; FASN, синтаза жирних кислот; ACLY, цитратна ліаза АТФ; OXCT1, 3-оксикислота CoA-трансфераза 1; BDH1, 3-гідроксиметил-3-метилглутарил-КоА ліаза; HMGCL, 3-гідрокси-3-метилглутарил-КоА ліаза; PYGM, глікогенфосфорилаза; PHKA1, регуляторна субодиниця фосфорилаза-кінази Альфа 1; PHKA2, регуляторна субодиниця фосфорилаза-кінази Альфа 2; UAP1, UDP-N-ацетилглюкозамінпірофосфорилаза 1; HBP, біосинтетичний шлях гексозаміну; ППС, пентозофосфатний шлях; ЯМР, факторизація невід’ємних матриць; MetS, метаболічний синдром; OGA, O-GlcNAcase; ЛШ, лівий шлуночок; WGA, агглютинін зародків пшениці; OGT, N-ацетилглюкозамінілтрансфраза; GYG1, біосинтез глікогену глікогенін1; PAS, Періодична кислота-Шифф

Вступ

Метаболічний синдром (MetS) був встановлений як попередник серцевої патології та пов’язаний із змінами серцевого енергетичного обміну. Хоча роль метаболізму в серцевій роботі протягом останніх 20 років була затьмарена появою та популярністю генетичного аналізу, зараз зростає оцінка метаболічних процесів, пов'язаних з наявністю енергетичного субстрату міокарда, що може сприяти прогресуванню серцевої патології.

MetS - це сукупність метаболічних станів, включаючи ожиріння, гіперглікемію, резистентність до інсуліну, гіпертригліцеридемію, підвищений рівень ЛПНЩ у плазмі крові, високий кров’яний тиск та дисфункцію ендотелію, що піддає пацієнтів ризику серцевих захворювань та діабету [1]. З огляду на багатогранну природу MetS, малоймовірно, що одномолекулярні біомаркери або порушення регуляції можуть адекватно захоплювати або прогнозувати його розвиток [2]. Таким чином, останні дослідження зосереджуються на застосуванні кількісних методів для одночасного скринінгу великого набору метаболітів для характеристики внутрішньоклітинного метаболічного середовища MetS.

Цільові дані метаболоміки щодо набору полярних метаболітів у плазмі крові, головним чином деяких амінокислот та їх похідних, нещодавно були повідомлені у пацієнтів із ожирінням та MetS [3, 4]. Хоча аналізи метаболоміки крові та інших рідин у організмі дають цінні результати, вигідно аналізувати зміни рівня тканин у міокарді, враховуючи його унікальний метаболізм. В даний час проводиться активне дослідження ролі метаболічних змін у міокарді людини, хоча цьому заважає труднощі, властиві отриманню людської тканини [5]. Тут ми використовуємо велику тваринну модель свиней, яка розробляє відмітні критерії людського MetS, щоб подолати розбіжності в обробці метаболітів між моделями людей та дрібних тварин та труднощі, пов'язані з отриманням людської тканини. Як було продемонстровано у йоркширських свиней, за відносно короткий проміжок часу при харчуванні гіперкалорійною гіперхолестеринемічною дієтою розвивається MetS, який майже ідентичний людині [6, 7].

Тут ми використовуємо індуковану дієтою MetS дієту з високим вмістом жиру та контроль за нежирною дієтою (LD) йоркширських свиней, щоб встановити метаболічну картину ідентичності MetS у міокарді, застосовуючи комбінований експериментальний та неконтрольований нерозрізнений факторизаційний матричний коефіцієнт (NMF) обчислювальний підхід, узгоджена інтеграція метаболоміки з транскрипцією та фізіологічними даними. Загалом, наші дані та аналіз дають уявлення про ідентичність MetS в міокарді і представляють важливий крок вперед до розкриття цілей для втручання та контролю процесів захворювання міокарда в MetS.

Результати

Вплив гіперкалорійної гіперхолестеринемічної дієти на фактори ризику MetS міокарда

Індукований дієтою MetS у нашій моделі свиней пов’язаний зі зміною структури міокарда, артеріального тиску та метаболізму міокарда (рис. 1). Ми зареєстрували, що гістологічні зрізи тканин лівого шлуночка, отримані від чотирьох свиней на гіперкалорійній гіперхолестеринемічній дієті, демонструють наявність підвищеного відкладення колагену (рис. 1А, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001) та накопичення внутрішньоклітинних ліпідних тіл (рис. 1B; n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001) разом зі значно нижчим відкладенням глікогену (рис. 1C; n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,001) порівняно зі свинями на контрольній нежирній дієті ( LD). Як показано на рис. 1D (n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0.001), свині MetS мають значно підвищений систолічний та діастолічний артеріальний тиск та збільшення ваги після дієти (рис. 1E; n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001) порівняно з тваринами LD. У тварин групи MetS розвинулись ключові компоненти метаболічного синдрому, включаючи підвищену дисліпідемію (рис. 1F, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001), LDL у плазмі крові (Fig. 1G, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001) і глюкози в плазмі натще (рис. 1H, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001).

MetS та LD свиней гістологічно порівнюють, використовуючи вбудовану в парафін або кріоконсервовану тканину міокарда лівого шлуночка. Дані представлені як середні значення ± SD (n = 4 MetS, n = 4 LD). Репрезентативні зображення тканини міокарда показані в полі потужності x20, ** p Рис. 2. Метаболомічні ознаки реакції міокарда на дієту отримують за допомогою NMF.

LC/MS-MS застосовували для індивідуального виявлення та вимірювання полярних метаболітів (280 полярних метаболітів) у серцевій тканині лівого шлуночка від інтактних самців свиней Йоркшира (MetS n = 6, LD n = 6). (A) На основі отриманих LC/MS-MS 12 наборів даних свиней з 280 полярних метаболітів, NMF витягував ознаки метаболічних процесів, які чітко відстають у MetS проти LD. Особистість окремих свиней наведена під стовпчиками. Підписи P1, P2, P3 та P4 відображаються кольором під стовпчиками. (Б) Кластерна дендрограма, сформована за допомогою неконтрольованої ієрархічної кластеризації на основі внесків чотирьох підписів, визначених NMF, до бази даних метаболоміки 12 свиней (коефіцієнт кофенетичної кореляції 0,92). (C) Надмірно представлені відомі шляхи в підписі P2 (LD) проти підпису MetS (P4) визначаються в MetaboAnalyst 4.0. Їх значення p показано кольоровою гістограмою праворуч.

Загалом, порівняння обох ознак свідчить про гліколіз, жирні кислоти, HBP (біосинтетичний шлях гексозаміну), дисбаланс глікогенолізу в MetS.

Склад метаболітів Р2 і Р4.

РНК-seq застосовується для оцінки відносних змін рівня мРНК ферментів у тканинах MetS та LD міокарда. Ділянки показують рівні мРНК у MetS (зелені бочки) проти LD (фіолетовий) чотирьох окремих свиней MetS та чотирьох свиней LD; PGAM1 (p = 6,2x10 -2), ENO1 (p = 2,7x10 -4), GAPDH (p = 0,97); PGM3 (p = 8,5x10 -3), UAP1 (p = 6x10 -1), FASN (p = 0,01); ACAT2 (p = 0,09), ACLY (p = 0,6), CPT1A (p = 2,5x10 -7), HMGCL (p = 0,04), OXCT1 (p = 4,8x10 -8), BDH1 (2,4x10 -12), PYGM (p = 1,4x10 -6), PHKA1 (p = 2,8x10 -8), PHKA2 (p = 0,08) та GYG1 (p = 1,4x10 -7). Дані представлені як середні значення ± SD (нормалізовані показники LD = 4, MetS = 4; p 70%, p Рис. 5. Серцевий білок O-GlcNAcylation в умовах MetS та LD.

Серцеві тканини LD і MetS відрізняються за вмістом білків O-GlcNAcylated. (А) Парафінові зрізи тканин фарбували анти-O-GlcNAcylated антитілом (червоним) та альфа-актином гладких м’язів (зеленим). ДНК фарбували DAPI (синій). Ідентичність зрізів тканин (LD-пісний контроль дієти, MetS-тварини, що харчуються дієтою з високим вмістом жиру, та MetS + Ab-конкуренти - ділянки свиней MetS після введення антитіл N-ацетилглюкозаміну) показані у верхній частині. Стовпчики показують середнє значення репрезентативних незалежних зрізів тканин від MetS та LD (n = 6 на групу) та MetS, які отримували антитіла-конкурента (cAb). (B) Вестерн-блот із тканинними лізатами (50 мкг білка/смуга) від трьох репрезентативних свиней LD (доріжки 1, 2, 3) та трьох свиней MetS (доріжки 5, 6, 7); смуга 4 показує лізат після введення 5 мкг N-ацетилглюкозаміну в якості конкурента. Стовпці праворуч представляють середні відносні значення сигналів специфічних антитіл. Дані представлені у вигляді середніх значень ± SD; *** p Рис. 6. Вміст OGT та OGA у серцевих тканинах LD та MetS.

(А) Імунофлуоресценція, що показує відмінності у вмісті OGA (червоний) у тканинах LD та MetS, тоді як їх вміст OGT (червоний) майже ідентичний: зелений колір показує антитіла до альфа-актину гладкої мускулатури, а синій - ядерну ДНК. Інтенсивність червоного фарбування на поверхні з рівною кількістю ядер вимірювали за допомогою NIH ImageJ 1,31, а стовпчаста діаграма праворуч представляє середнє значення фарбування OGT та OGA тканинних зрізів свиней MetS, представлених як відносні пікселі (n = 4, *** p 6 зчитування/зразок парного кінця з діапазоном 43x10 6 -139x10 6 у GENEWIZ (Південний Плейнфілд, Нью-Джерсі). Зчитування були зіставлені з контрольним геномом свині (USMARCv1.0) за допомогою вирівнювача STAR [26 ] та кількісний підрахунок зчитування для всіх генів, анотованих (USMARCv1.0) з HTSeq- count, версія 0.5.3p9 [27]. Диференціальний аналіз експресії генів проводили на GENEWIZ з пакетом біопровідників DESeq. Відбір зразків тварин для РНК- seq було випадковим.

Двовимірна тонкошарова хроматографія (TLC)

ТШХ проводили з вилученими полярними метаболітами на силікагельних пластинах G з флуоресцентним індикатором при 254 нм (Sigma-Aldrich). Розділення першого розміру проводили в системі кислотних розчинників (етанол - 5N NH4OH-H2O) у співвідношенні 200: 9: 40; другий вимір у системі основного розчинника (нахально мурашино-мурашина кислота-вода) співвідношення 110: 20: 5. Плями визначаються в УФ світлі лише при міграції стандартної молекули.

Періодичний кислотно-шифтовий (PAS), ліпідне масляне червоне фарбування O, фарбування Picrosirius Red

Фарбування періодичною кислотою-Шиффом (PAS) проводили за допомогою системи фарбування PAS фірми Sigma-Aldrich (процедура 395). У серцевій тканині фарбування відбувається в основному в результаті реакції з глікогеном, хоча інші вуглеводи з 6 макромолекулами також можуть реагувати. Набір для фарбування ліпідів (масло червоного кольору O) (Bio Vision, каталог № K580-24) використовували для фарбування для накопичення ліпідів. Червоне фарбування Picrosirius проводили з набором від Polysciences, Inc. Для кількісної оцінки даних використовували чотири предметних стекла на тварину; було зафіксовано чотири зображення із випадкової області на слайд, і середнє позитивне фарбування визначали за допомогою програмного забезпечення Image J.

Полярні метаболіти LC/MS-MS

Полярні метаболіти екстрагували із 100 мг замороженої тканини з 1 мл крижаного 80% (об/об) метанолу та 0,6 мл ацетонітрилу та аналізували за допомогою гібридного потрійного квадрупольного мас-спектрометра 5500 QTRAP (AB/SCIEX), з'єднаного з Prominence UFLC Система ВЕРХ (Shimadzu) із SRM, як у [8]. Пікові області від загального іонного струму для кожного переходу метаболіту SRM інтегрували за допомогою програмного забезпечення MultiQuant v2.0 (AB/SCIEX). LC/MS-MS проводили для окремих зразків свиней (12 свиней у 12 незалежних пробігах). MetaboAnalyst 4.0 був використаний для ідентифікації відомих шляхів участі.

Невід'ємна факторизація матриці (NMF)

Неотрицательную факторизацію матриці (NMF) застосовували, як показано в [10], для пошуку метаболічних сигнатур у наборі даних LC/MS-MS з 280 метаболітів у аналізованих йоркширських свиней (MetS n = 6, LD n = 6) загалом 12 свиней . Ієрархічну кластеризацію проводили, як у [26, 28]. Всі моделювання проводились на кластерах Linux в Національній лабораторії Лос-Аламоса.