Кількість вільних сполук глікації в слині

Ролі Концептуалізація, формальний аналіз, розслідування, методологія, написання - оригінальний проект

Афілійована кафедра харчової хімії, Technische Universität Dresden, Дрезден, Німеччина

Ролі Концептуалізація, адміністрування проектів, нагляд, написання - огляд та редагування

Афілійований кафедра харчової хімії, Technische Universität Dresden, Дрезден, Німеччина

Ролі Формальний аналіз, розслідування

Афілійований кафедра харчової хімії, Technische Universität Dresden, Дрезден, Німеччина

Ролі Концептуалізація, придбання фінансування, адміністрування проектів, нагляд, написання - огляд та редагування

Афілійований кафедра харчової хімії, Technische Universität Dresden, Дрезден, Німеччина

Фрідеріке Маніг,
Майкл Гельвіг,
Франциска Піц,
Томас Генле

Цифри

Анотація

Цитування: Manig F, Hellwig M, Pietz F, Henle T (2019) Кількість вільних сполук глікації в слині. PLoS ONE 14 (9): e0220208. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220208

Редактор: Гулам М.Д. Ашраф, Університет короля Абдулазіза, Саудівська Аравія

Отримано: 3 квітня 2019 р .; Прийнято: 10 липня 2019 р .; Опубліковано: 18 вересня 2019 р

Наявність даних: Всі відповідні необроблені дані були навіть завантажені за допомогою сховища відкритого доступу та архіву OpARA тут: https://opara.zih.tu-dresden.de/xmlui/handle/123456789/1416.

Фінансування: Дані були сформовані в рамках європейського проекту SALIVAGES. Ініціатива спільної програми (JPI) підтримує консорціум SALIVAGES в рамках програми «Здорове харчування для здорового життя» (HDHL). Автори висловлюють визнання Федеральному міністерству досліджень та освіти Німеччини (BMBF) за підтримку проекту з FM (грантовий номер 01EA1703). Фінансист не брав участі у розробці досліджень, зборі та аналізі даних, прийнятті рішення про публікацію чи підготовці рукопису.

Конкуруючі інтереси: Автори заявили, що не існує конкуруючих інтересів.

Скорочення: 3-DG, 3-дезоксиглюкозон; ВІК (и), кінцевий продукт (и) вдосконаленого глікування; AP (s), продукція (и) Amadori; Арг, аргінін; CEL, N ε-карбоксиетиллізин; ХМЛ, N ε-карбоксиметиллізин; FruLys, N ε -фруктозилілізин; ВЕРХ, рідинна хроматографія високого тиску; LC-MS, рідинна хроматографія в поєднанні з мас-спектрометрією; Lys, лізин; MG-H1, гідроімідазолон 1, отриманий метилгліоксалем; МГО, метилгліоксаль; MRP (s), продукт (и) реакції Майяра; NFPA, нонафторпентанова кислота; Пір, Піралін

Вступ

Щоденне споживання MRP розраховували після всебічного аналізу різних продуктів харчування з 3,1 ± 1,0 мг ХМЛ (

0,015 ммоль), 2,3 ± 0,8 мг CEL (

0,01 ммоль) та 21,7 ± 6,7 мг MG-H1 (

0,1 ммоль) [18]. Pyr як найважливіший дієтичний MRP оцінювали із споживанням від 20 до 40 мг (

0,08–0,16 ммоль) [19]. Після прийому всередину гліковані білки зазнають протеолітичного розщеплення [20–22]. Транслокація отриманих пептидів та амінокислот залежить від хімічної природи MRP. Дослідження потоку in vitro на клітинах Caco-2 передбачали перенесення через базолатеральну мембрану для MRP з неполярним бічним ланцюгом, таким як Pyr, але не для молекул із зарядженим бічним ланцюгом, таким як ХМЛ [23,24]. У дослідженнях з добровольцями-людьми було виявлено низьке відновлення FruLys в сечі та фекаліях, але високе відновлення Pyr в сечі, що свідчить про поглинання Pyr, але не FruLys [25–27]. Широкий діапазон вільних MRP, таких як ХМЛ, CEL, MG-H1 тощо, був визначений у плазмі людини в наномолярному діапазоні [11].

В принципі, амінокислоти можуть бути визначені в поті та слині [35,46,47]. Це піднімає питання про те, чи можна виявити MRP у слині людини чи ні. Метою цього дослідження було встановити мультиметод LC-MS/MS та дослідити слинний "AGEome" щодо AGEs CML, CEL, MG-H1, Pyr, а також AP FruLys з однорідною групою суб'єктів.

Матеріал і методи

Хімікалії

Ацетонітрил класу LC-MS та метанол класу ВЕРХ були придбані у VWR Prolabo (Дармштадт, Німеччина). Подвійну дистильовану воду (система подвійної дистиляції Bi 18E, QCS, Maintal, Німеччина) використовували для розчинників для LC-MS аналізу, а ненафторпентанову кислоту (NFPA) від Sigma-Aldrich (Steinheim, Німеччина). Довідковий матеріал для калібрування був синтезований, як описано раніше: N ε -фруктозиллізин [48], пірралін [24,49], ХМЛ [23], CEL [23] та MG-H1 [23]. Внутрішні стандарти, позначені стабільними ізотопами для аналізу ВЕРХ-МС/МС, синтезували таким же чином, але з використанням [13 C6, 15 N2] лізину ([13 C6, 15 N2] Pyr) та [13 C6] аргініну ([13 C6] MG -H1) замість немічених сполук. [13 C3] CEL синтезували, як описано нижче. [2 H2] ХМЛ отримували з PolyPeptide (Страсбург, Франція), [13 C6, 15 N2] лізину та [13 C3] пірувату натрію від Campro (Берлін, Німеччина) та [13 C6] аргініну від Eurisotop (Саарбрюккен, Німеччина) . Очищення проводили за допомогою напівпрепаративної іонообмінної хроматографії, а чистоту та ідентичність продуктів оцінювали за допомогою ядерно-магнітно-резонансної спектроскопії, мас-спектрометрії та амінокислотного аналізу.

Синтез [13 C3] N ε-карбоксиетиллізину

Аналітичні дані: ВЕРХ-МС/МС: tR, 8,4 хв; фрагментація (100 В, 10 еВ) [M + H] + (m/z 222), 130 (100), 84 (91), 222 (24), 175 (5), 159 (4). Вміст = 76,2%, виходячи з калібрування за маркованим стандартом. Вихід: 43,5 мг (59,7%).

Вивчати дизайн

Дослідження було схвалено Комітетом з етики Technische Universität Dresden, Німеччина (посилання: AZ 439112017). Письмова згода була отримана кожним учасником дослідження. Всього в дослідження було включено 55 учасників, з яких 22 суб'єкти повинні були бути виключені здебільшого через низьку кількість слини. Рівні МРП натщесерце аналізували в двох примірниках у зразках від 33 здорових метаболіків. Проби слини брали щодня перед сніданком. Для дослідження передбачуваного дієтичного впливу на рівень MRP у слині шістьох суб’єктам пропонували протягом двох днів їсти не підігріту їжу, практично не містить MRP [51] (переважно овочі, фрукти, несмажені горіхи). Відбір проб проводили перший день до третього дня ранку. Ця ж група випробовуваних збирала зразки ще протягом трьох днів, харчуючись звичними дієтами, включаючи багату MRP їжу.

Відбір проб

Збір слини натще виконували о 8 ранку за допомогою Salivettes (Сарштедт, Німеччина). Протокол виробника для відбору проб був адаптований для використання Salivettes для збору слини без стимуляції. Випробовуваних просили почистити зуби без зубної пасти, прополоскати рот водою і почекати п’ять хвилин. Селівети розміщували посередині язика. Випробовуваних просили не ворушити язиком протягом трьох хвилин після збору слини.

Підготовка зразків слини для аналізу MRP

З слини виділяли слину центрифугуванням (2 хв, 2500 г). 500 мкл слини змішували з 10 мкл розчину внутрішнього стандарту, а також 490 мкл крижаного ацетонітрилу/метанолу (70/30, об./Об.). Через 10 хв при 4 ° С пробірки центрифугували (10000 г, 10 хв), супернатант випаровували під азотом насухо і залишок повторно розчиняли в 90 мкл 20 мМ NFPA. Зразки зазвичай аналізували у двох примірниках. Подвійну дистильовану воду використовували як основу для заготовок. Під час обробки зразків заготовки обробляли як зразки. Розчини для зовнішнього калібрування CML, CEL, MG-H1, Pyr, FruLys, а також Arg та Lys з кожним із відповідних внутрішніх стандартів ізотопологу також випаровували під азотом насухо і розчиняли в 20 мМ NFPA. Калібрувальна крива для MRP була лінійною від 0,003-0,15 нг/мл, а для амінокислот - від 0,1-150 мкг/мл.

Рідка хроматографія високого тиску з тандемною мас-спектрометричною детекцією (ВЕРХ-МС/МС)

Безкоштовні MRP визначали кількісно на системі HPLC-MS/MS, що складається з бінарного насоса (G1312A), Інтернет-дегазатора (G1379B), автозабірника (G1329A), колонкового термостата (G1316A), детектора діодного масиву (G1315D) потрійний квадрупольний мас-спектрометр (G6410A; все від Agilent Technologies, Böblingen, Німеччина). Азот використовували як інгалюючий газ у джерелі ESI з потоком газу 11 л/хв, температурою газу 350 ° C і тиском небулайзера 35 psi, а напруга капілярів становила 4000 В. Проби проводили на Phenomenex Для хроматографічного розділення використовували колонку Kinetex C-18 (50 х 2,1 мм, 1,7 мкм, 100 Å) та об'єм ін'єкції 5 мкл. Розчинник A складався з 10 мМ NFPA у воді, розчинник B - 10 мМ NFPA в ацетонітрилі. Використовували градієнт (0 хв, 5% B; 10 хв, 32% B; 11 хв, 85% B; 14 хв, 85% B; 15 хв, 5% B) зі швидкістю потоку 0,25 мл/хв. Для збору даних було використано програмне забезпечення Mass Hunter B.02.00 (Agilent). Кількісне вимірювання проводили з використанням режиму MRM з іонними переходами, показаними в таблиці 1. Всі зразки аналізували у двох примірниках.

Статистика та перевірка методів

Кожен окремий аналіт (сірий) аналізували відповідно до відповідного внутрішнього стандарту ізотополога (чорний) за допомогою специфічних переходів MRM.

Розрахунок межі виявлення (LOD) та межі кількісного визначення (LOQ) базувався на методі калібрувальної кривої з використанням калібрувальної кривої для кожного аналіту. Діапазон концентрацій, охоплений калібруванням, давав лінійну реакцію сигналу з коефіцієнтами детермінації між 0,980 (MG-H1) та 0,999 (інші аналіти), відповідно. Дані перевірки наведені в таблиці 2. Відповідні LOD та LOQ узгоджуються з даними, опублікованими раніше [11]. Розраховували коефіцієнт відновлення від 72,7 до 110,3% для аналізу за допомогою Salivettes. Під час нашого дослідження ми встановили, що бавовна Salivettes зберігає до 27% аналіту у випадку FruLys або навіть призвела до більш високого виходу аналітів (CEL) MRP у слині, швидше за все, через збагачення. Встановлено, що повторюваність вимірювань LC-MS коливається в межах від 0,8% (Pyr) до 14,7% (MG-H1), розраховано повторюваність для підготовки зразків від 1,4% до 16,3%.

Індивідуальна варіація рівнів MRP у слині

Квадрат позначає середнє значення, лінія позначає медіану. CEL був виявлений у зразках 26/99; Представлені дані відносяться до зразків із співвідношенням піків CEL S/N> 3.

Для подальшої оцінки взаємозв'язку між появою MRP, кореляційний аналіз між окремими аналітами у слині проводили за моделями Спірмена (таблиця S3). Щодо MRP, помірна кореляція спостерігалась для Pyr та CML з FruLys, а також Lys та FruLys. Цікаво, що це також стосується Lys та Arg, демонструючи помірну кореляцію з більшістю досліджуваних MRP. Це спостереження може бути пов'язане з подібними механізмами транспортування Arg та Lys від крові до слини, що може бути також у випадку з MRP, що походять від Arg та Lys. CEL є єдиним аналітом, який не виявляє кореляції з будь-якою іншою сполукою, проаналізованою в цьому дослідженні.

Індивідуальні зміни рівня MRP у слині

Щоб оцінити внутрішньоіндивідуальні варіації між різними днями рівнів MRP у слині кожного суб'єкта, суб'єктам пропонувалося дати зразки протягом трьох днів поспіль. Зразки вимірювали, як зазначено вище, і внутрішньоіндивідуальну варіацію обчислювали як коефіцієнт варіації. Аналіз виявив високі внутрішньоіндивідуальні варіації FruLys, MG-H1, лізину та аргініну, коливаючись від 5 до 80–90% (див. Таблицю 3 та рис. S1). Примітно, що FruLys продемонстрував високі, а Pyr низькі між- та інтраіндивідуальні варіації. Інтеріндивідуальні варіації перекривають інтраіндивідуальні варіації. Профіль досліджених MRP від різних суб’єктів наведено на рис. S1. Інтраіндивідуальні варіації можуть бути пояснені аліментарним споживанням MRP, поведінкою куріння, індивідуальними метаболічними або навіть патофізіологічними характеристиками. Було описано кілька речовин, що слина відображає концентрацію крові [31,32,44,56]. Це припущення підтверджується двома аргументами: Сильного залежності від віку збільшення MRP у біологічних рідинах у цьому дослідженні не спостерігалось, ані в літературі не було продемонстровано [57].

Попереднє дослідження, що стосується дієтичного впливу

Рівні слини досліджуваних аналітів виявляли високі між- та внутрішньоіндивідуальні варіації, що не могло бути пояснене жодним із особистих параметрів, заданих в анкеті. Оцінка прийому їжі учасниками, як повідомляється в анкеті, передбачала дієтичний вплив на рівень MRP у слині. Для того, щоб проаналізувати, чи залежать концентрації окремих MRP у слині від вживання їжі, групі добровольців, однорідних за віком та поведінкою куріння (легкі чи некурящі), було запропоновано їсти сиру або не підігріту їжу протягом двох днів. Постачання білка забезпечувалося вживанням несмажених, не підігрітих горіхів (кеш'ю було виключено, оскільки кешью може нагріватися під час лущення та обробки) та приблизно. Рис. 3. Дослідження аліментарного впливу на слинні реакційні сполуки Майяра.