Картування регулона регулятора поглинання заліза вібріонової холери розширює його відому мережу генної регуляції

Автор: Джон Дж. Мекаланос, 12 червня 2011 р. (Надіслано на огляд 4 квітня 2011 р.)

картування

Анотація

ChIP у поєднанні з секвенуванням наступного покоління (ChIP-seq) революціонізував картографування цілого геному ділянок білка, що зв’язують ДНК. Хоча ChIP-seq швидко заручився підтримкою в еукаріотичних системах, він залишається недостатньо використаним для картографування місць зв'язування регуляторів транскрипційних бактерій. Використовуючи регулятор поглинання заліза, що реагує на залізність (Fur), ми повідомляємо про простий, широко застосовуваний метод ChIP-seq у збуднику холерних вібріонів. Поєднуючи результати ChIP-seq з наявними даними мікрочипів, ми уточнюємо пряму та непряму регуляцію хутра відомих генів, що реагують на залізо. Ми перевіряємо підмножину місць зв’язування хутра in vivo та демонструємо загальний мотив, присутній у всіх піках ChIP-seq хутра, що покращує спорідненість до зв’язаного очищеного хутра V.holerae. Подальший аналіз показує, що хутро V.holerae безпосередньо регулює кілька додаткових генів, пов'язаних з місцями зв'язування хутра, розширюючи роль цього фактора транскрипції у регуляції утворення рибосом, додаткових транспортних функцій та унікальних сРНК.

Транскрипційні регулятори відіграють важливу роль у клітинних реакціях, змінюючи моделі експресії генів, що в кінцевому підсумку призводить до протеомних та фенотипових змін. Профілі експресії бактерій, у яких відсутні регулятори транскрипції, успішно використовуються для широкого визначення генів, на які впливає видалений регулятор (1–4). Незважаючи на надання інформативних даних, сам по собі транскрипційний аналіз не може розрізнити прямий та непрямий регуляторний ефект або визначити регульовані гени, які можуть бути транскрипційно тихими в умовах тесту. Найбільш прямим способом пошуку генів, контрольованих транскрипційним регулятором, є ChIP з подальшою ідентифікацією послідовностей фрагментів ДНК, асоційованих з осадженим регулятором (розглянуто в посиланні 5). Поєднання ChIP з технологією мікрочипів (ChIP-ChIP) надало деякі перші дані про загальногеномні місця транскрипційного фактора зв'язування як в прокаріотичних, так і в еукаріотичних системах (оглянуті в посиланнях 6 і 7). Останні технологічні досягнення дозволили ChIP поєднати з послідовністю наступного покоління (ChIP-seq), яка забезпечує більший охоплення, вищу роздільну здатність і менше шуму та вимагає менше вибірки, ніж ChIP-ChIP (8).

Після його введення в 2007 р. ChIP-seq був швидко прийнятий для аналізу факторів транскрипції еукаріотів (розглянутий у посиланні 8), але досі не має значного застосування для вивчення бактеріальних регуляторів транскрипції. Наскільки нам відомо, опубліковано лише два дослідження з використанням ChIP-seq у бактеріях, що повідомляють про картографування ремоделюючих хроматину білків HN-S та Fis у Escherichia coli (9) та регулятора транскрипції DosR при мікобактеріях туберкульозу (10). Ця бідність досліджень може відображати відсутність антитіл якості ChIP до бактеріальних білків (11) або неоптимальну експресію регулятора, що представляє інтерес, в лабораторних умовах.

Білок бактеріального регулятора поглинання заліза (Fur) регулює транспорт заліза та гомеостаз у багатьох бактерій (розглянуто в посиланнях 12–14). Залізо необхідне для ферментативних функцій; однак надлишок вільного заліза може бути шкідливим, збільшуючи окислювальну шкоду (15). Пов’язаний з Fe 2+, Fur зв’язується з конкретними ділянками ДНК, які називаються «коробочками хутра», розташованими поблизу або в промоторній області цільових генів, блокуючи доступ до РНК-полімерази та пригнічуючи експресію генів.

Опис коробки з хутром та її асоціації з хутром є складним (посилання 16 та 17 та переглянуте в посиланнях 13 та 18). Фурбокс був описаний спочатку у кишкової палички як паліндромна послідовність 19 п.о., що вміщує димер хутра (19); однак деякі сайти, що зв'язують хутро в кишковій паличці, відповідають лише 11 із 19 передбачуваних консенсусних основ. Шубки для хутра прогнозували для інших бактерій, включаючи холерний вібріон, на основі вирівнювань мотивів 5 ′ UTR генів, регульованих хутром (20). Кілька ДНК-зв'язуючих характеристик Fur неможливо пояснити простою паліндромною послідовністю. Експерименти з друку ніг показують, що хутро захищає область, значно більшу, ніж коробка хутра, припускаючи, що вона взаємодіє з ДНК поза передбачуваною областю. Крім того, численні димери хутра можуть полімеризуватися, обертаючи навколо ДНК ділянки, які не мають відповідних послідовностей консенсусу в області Fur (21, 22). Щоб допомогти пояснити ці та інші явища, були запропоновані альтернативні ящики з хутра, включаючи послідовність, що включає три повтори 6-bp (23) та мотиви 13-1 bp, що перекриваються 7-1-7 (24).

Для більш повного визначення регуляції vcFur ми демонструємо просту, широко застосовувану платформу для картографування сайтів, що зв’язують фактори транскрипції у V. cholerae, за допомогою ChIP-seq. Ми порівняли доступні транскрипційні відповіді хутряних мутантів з нашими геномними даними про розташування зв'язування, щоб визначити прямі та непрямі регуляторні цілі vcFur, а також додаткові сайти зв'язування. Наші результати забезпечують біохімічну перевірку попередніх прямих регуляторних прогнозів vcFur, визначають поле vcFur з посиленим зв'язуванням з vcFur та наслідки для зв'язування vcFur-ДНК та визначають додаткові ролі vcFur у регуляції утворення рибосом, транспортних функцій та сРНК. Наші результати підтверджують використання цього методу ChIP-seq для бактеріальних регуляторів транскрипції, забезпечують підтримку поєднання інформації про транскрипційну інформацію про сайт зв'язування з наявним аналізом експресії та значно розширюють мережу впливу цього майже повсюдного бактеріального регулятора транскрипції.

Результати

ChIP-Seq визначає прямі та непрямі цілі серед генів, регульованих vcFur.

Встановлено, що хутрозалежна регуляція різних генів змінюється залежно від фази росту та стану (26-28). Рівні білка vcFur потроюються при вступі в стаціонарну фазу (25), потенційно змінюючи спектр його ДНК-зв'язуючих мішеней. Ми припустили, що більш високі рівні vcFur краще розкриють весь спектр його сайтів геномного зв'язування.

Відомі vcFur-регульовані гени, асоційовані з vcFur ChIP-піками

Аналіз ChIP-Seq розширює кількість сайтів, що зв'язують vcFur.

Ми виявили додаткові 34 піки ChIP vcFur, пов'язані з генами/рНК (табл. 2). Ми широко класифікували ці гени за категоріями транспорту, транскрипційної та поступальної регуляції, рухливості, посередницького метаболізму та гіпотетичних ORF. Чотири піки vcFur ChIP перекривали стартові кодони множинних сусідніх генів. Відсутність даних виразів, що вказують на контроль vcFur, виключало негайну асоціацію піків лише з одним ORF.

Нові vcFur ChIP-асоційовані піки ORF та сРНК

Щоб перевірити зв'язування vcFur з цими локусами, ми вибрали підмножину нових місць розташування піків та застосували кількісну ПЛР (qPCR), щоб визначити кратне збагачення цих геномних локусів у наших зразках vcFur ChIP порівняно з контрольною ДНК перед ChIP (Таблиця 3). Для довідки ми визначили збагачення зв'язування vcFur вище за течією з відомими регуляторними мішенями - геном рецептора ентеробактину A (irgA) і tonB1, а також двома нецільовими геномними локусами [ендонуклеаза IV (nfo) та ізоцитратдегідрогеназа (icd)] як негативні контролі. Кількісна оцінка кратного збагачення семи нових піків vcFur, виявлених ChIP-seq, показала еквівалентне або більше збагачення, ніж зв'язування з регіонами промотору irgA та tonB1. Ці результати підтверджують наші піки ChIP як такі, що містять автентичні сайти, що зв'язують vcFur. Вражаюче, що шість із цих семи зв’язуючих vcFur сайтів показали більше збагачення ChIP, ніж відомий промотор гена tonB1, регульований vcFur. Крім того, два з цих сайтів, що зв'язують vcFur, показали більше збагачення ChIP, ніж область промотору irgA. Особливо слід зазначити сайт зв’язування vcFur перед альтернативним білком рибосом, VC0878, який показав збагачення в 300 разів.

Перевірка зв'язування vcFur з новими геномними локусами

Аналіз ChIP-Seq визначає посилений хутряний ящик V.holerae.

Коробка vcFur ChIP Fur мала більш жорсткі вимоги щодо положення залишків, ніж коробка vcFur, передбачена дослідженнями мікрочипів. Ми порівняли зв'язування очищеного vcFur з коробками vcFur, визначеними мікрочипами та ChIP-seq, та контрольним дуплексом ДНК polyA/T. Ми використовували vcFur, відновлений з Zn 2+, оскільки цей іон необхідний для структури vcFur, не швидко окислюється і дозволяє vcFur зв’язувати відомі промотори так само ефективно, як vcFur, що містить Fe 2+ (38). Очищений vcFur зв’язував як vcFur, визначені мікрочипом, так і ChIP-seq, але не зв’язував контрольний дуплекс (рис. 1C). Цікаво, що vcFur обмежив визначений ChIP блок vcFur у 3,1 ± 1,1 рази сильніше, ніж передбачений раніше блок vcFur (рис. 1C). Ідентифікація цього консенсусного коробки Fur у всіх піках ChIP надалі підтверджує валідність цих геномних областей як справжніх сайтів, що зв'язують vcFur.

ChIP-Seq - Ідентифіковані сайти, що зв'язують, розширюють набір генів, регульованих vcFur, і сРНК.

vcFur-залежна регуляція генів, асоційованих з новими піками ChIP vcFur

Обговорення

Обчислювальні методи успішно передбачили сайти, що зв’язують vcFur, у геномі V.holerae (42, 43). Однак жодне обчислювальне дослідження не змогло передбачити спектр сайтів зв'язування vcFur, виявлених у нашому аналізі ChIP-seq. Справедливості заради, біоінформаційні алгоритми повинні покладатися на наявні в даний час експериментальні дані, які можуть бути неповними, для отримання мотивів пошуку. Буде цікаво визначити, як розширений набір сайтів зв'язування vcFur вплине на обчислювальні прогнози місць зв'язування хутра.

Поєднуючи аналіз ChIP-seq з наявними даними виразів, ми можемо чітко розрізнити пряме та непряме регулювання vcFur і тепер пропонуємо набагато ширшу роль vcFur у прямому регулюванні. Наш аналіз значно розширює кількість експериментально перевірених сайтів зв'язування vcFur і передбачає, що ще кілька генів перебувають під прямою регуляцією vcFur. Є кілька можливих причин, чому гени, пов’язані з нашими сайтами, що зв’язують vcFur, не були виявлені в дослідженнях мікрочипів. Цілі, такі як сРНК та невеликі ORF, такі як VC0878, не були включені в мікрочип і, отже, не були б перевірені. У мутантах хутра: Tn наші результати qPCR показали підвищення регуляції irgA більш ніж у 200 разів (Таблиця 4). Використовуючи qPCR, ми показали, що три гени, пов'язані з новими сайтами зв'язування vcFur, також регулювались у мутанті fur: Tn, але в значно меншій мірі, ніж irgA (табл. 4). Чутливість аналізу мікрочипів може бути недостатньо високою для виявлення цих відносно невеликих змін у експресії генів, або ці порівняно невеликі зміни можуть не бути відтворюваними серед експериментів.

Наші результати показують, що високий ступінь зв’язування vcFur в промоторній області не корелює безпосередньо з високим рівнем регуляції асоційованого гена (таблиці 2 та 3). Контекст сайту, що зв’язує vcFur, може бути настільки важливим, як важливий, або важливіший за спорідненість vcFur до сайту. Інші фактори транскрипції, такі як аеробний респіраторний білок (ArcA), регуляторний білок зниження фумарату та нітратів (Fnr) та циклічний білок рецептора AMP (CRP), можуть зв'язуватися в місцях поблизу або в місцях перекриття сайтів vcFur. Залежно від умов росту, ці фактори можуть значно збільшувати або зменшувати зв'язування vcFur у певному місці.

Ми показали пряму регуляцію трьох генів, асоційованих з новими піками vcFur, за допомогою мутанта fur: Tn (таблиці 2 та 4). VCA1098 поділяє сильну гомологію з транспортною субодиницею ABC нікелю NikA (40), і наші експерименти показують, що порушення VCA1098 зменшує чутливість V.holerae до позаклітинного нікелю (рис. 1D). Ці результати свідчать про те, що VCA1098 може відігравати певну роль у транспорті нікелю. Цікаво, що у Helicobacter mustelae нещодавно було показано, що кілька генів, анотованих для придбання заліза, використовуються для поглинання нікелю (44). Крім того, було показано, що NikA також зв'язує гем, що передбачає багатофункціональне використання VCA1098 (45). Наші результати також показали значне збагачення ChIP зв’язуванням vcFur з промоторною областю VC0878, альтернативним білком L31 рибосоми. Гомолог VC0878 Bacillus subtilis регулюється регулятором поглинання цинку Zur і допомагає захистити бактерію від цинкового голодування (46). Крім того, було показано, що транспорт цинку контролюється хутром у Pasteurella multocida (47). Пряма асоціація генів, потенційно задіяних у регуляції Ni 2+ і Zn 2+, свідчить про те, що vcFur може відігравати додаткові ролі, крім регуляції заліза.

Ми виявили сильні піки vcFur ChIP у міжгенних регіонах між VC0142/VC0143 та VCA0452/VCA0453. Ці піки не розташовані поблизу місця початку будь-якого гена. Лівний та ін. (41) ідентифікували сРНК у міжгенній області між VC0142/VC0143 під час обчислювального скринінгу для сРНК V.holerae. Наші північні блоти показали підвищену експресію цієї рНК в мутанті хутра: Tn (рис. 1Е). У поєднанні з локалізацією vcFur ChIP ми показали, що vcFur безпосередньо регулює цю невивчену сРНК. Ми також виявили сРНК у міжгенній області між VCA0452/VCA0453, яка не виявляла регулювання, залежного від vcFur; однак регулювання, залежне від vcFur, може відбуватися в різних умовах росту.

Перехресна регуляція хутра/RpoS спостерігалась у Vibrio vulnificus та E. coli (48, 49), але ми не спостерігали підвищення регуляції rpoS у мутанта fur: Tn (табл. 4). Як і у всіх інших генів, асоційованих з vcFur-зв'язуючими сайтами, сильна регуляція vcFur може зажадати альтернативних умов росту.

Ідентифікація кількох додаткових сайтів, що зв'язують vcFur, дозволила нам передбачити посилену послідовність консенсусу коробки V.Holerae Fur. Цей мотив був знайдений в межах піків vcFur ChIP поблизу поступальної початкової ділянки кожного пов'язаного ORF. Аналізи in vitro показали, що цей мотив зв’язував vcFur дещо краще, ніж передбачений раніше вік vcFur, який використовував лише підмножину нашої області зв’язування. Цікаво, що обидві коробки мають однаковий діапазон основ. Наші прогнози мають більш суворі вимоги до 3 ′ кінця, припускаючи, що ця область може забезпечити підвищене зв'язування з vcFur. Здатність нашого передбачуваного мотиву ефективно пов'язувати vcFur та його присутність у всіх виявлених піках ChIP (сайти, пов'язані з vcFur) допомагають підтвердити валідність нових сайтів, що зв'язують vcFur, про які повідомляється тут.

Матеріали та методи

Штами та плазміди наведені в таблиці S3. Секвенування проводили за допомогою одномолекулярного секвенсора HeliScope. Аналіз даних послідовності проводили за допомогою програмного забезпечення CLC геномних верстатів. 6XH його мічений vcFur на С-кінці очищали за допомогою афінної хроматографії. Для отримання детальної інформації див. Матеріали та методи SI.

Подяки

Ми вдячні доктору Д. Евен Камерону за підтримку у використанні бібліотеки транспозону V.holerae. B.W.D. була підтримана Меморіальним фондом медичних досліджень Джейн Коффін Чайлдс та Національною дослідницькою радою Канади Х. Л. Холмсом. Цю роботу підтримав грант Національного інституту охорони здоров’я AI-018045 (J.J.M.).

Виноски

  • ↵ 1 Кому слід адресувати листування. Електронна пошта: john_mekalanoshms.harvard.edu .