Геномна інтеграція ERRγ-HNF1β регулює ниркову біоенергетику та запобігає хронічним захворюванням нирок

Відредаговано Бертом У. О’Маллі, Медичний коледж Бейлора, Х'юстон, Техас, та затверджено 11 квітня 2018 року (отримано на огляд 21 березня 2018 року)

регулює

Значимість

Клітини ниркового епітелію (РЕК) містять рясні мітохондрії, необхідні для підтримки реабсорбції нирок електролітів, глюкози та амінокислот. Однак залишається недостатньо зрозумілим, як метаболізм мітохондрій координується з реабсорбційними функціями нирок. Тут ми показуємо, що делеція пов'язаних з естрогеном рецепторних гамм (ERRγ) в RECs призводить до серйозних порушень функції мітохондрій та реабсорбції нирок із наповненими рідиною кістами. ERRγ безпосередньо регулює мітохондріальний метаболізм і співпрацює в регулюванні генів реабсорбції нирок з печінковим ядерним фактором 1 бета (HNF1β), мутації якого викликають разюче подібну ниркову дисфункцію та кісти у тварин та людей. Ці висновки виявляють роль ERRγ у одночасній координації транскрипційної програми ниркових мітохондріальних мітохондріальних та енергоємних реабсорбційних функцій, що стосуються хвороби нирок.

Анотація

Мітохондрії - це органели, які генерують більшість клітинної енергії завдяки окисному фосфорилюванню (OxPhos) та окисленню жирних кислот (FAO). Їх оптимальна функція є основною для здоров’я. Мутації мітохондріальної ДНК та білків безпосередньо спричиняють захворювання мітохондрій, при цьому важкі дефекти часто спостерігаються в органах із високим вмістом мітохондрій та енергетичним попитом, включаючи нирки (1 kidney –3). Загалом було визнано, що дисфункція мітохондрій в цілому сприяє серцевим захворюванням, ожирінню, діабету, нейродегенерації, старінню та багатьом захворюванням нирок, включаючи гостру травму нирок, полікістоз нирок та хронічну хворобу нирок (ХХН) (1, 4 ⇓ ⇓ ⇓ - 8). ХХН характеризується поступовою втратою функції нирок з різною етіологією, не зовсім зрозумілою патофізіологією та відсутністю лікування. ХЗН характеризується як дисфункцією клітин клубочків, так і трубчастих клітин, а також порушенням регуляції обміну речовин (9). Транскриптомічні та метаболомічні дослідження свідчать про порушення мітохондріального OxPhos при багатьох захворюваннях нирок, включаючи ХХН (10, 11). Недавнє дослідження також показує, що ниркові мітохондріальні OxPhos і FAO є одними з найкращих нерегульованих клітинних шляхів як у пацієнтів із ХХН, так і на тваринних моделях (12).

Серед усіх клітин нирок канальці та збірні протоки клітини ниркового епітелію (РЕК) мають дуже високу щільність мітохондрій. Основною фізіологічною функцією REC є підтримка гомеостазу в організмі осмоляльності, кислотно-лужного балансу та обсягу позаклітинної рідини шляхом реабсорбції води, критичних поживних речовин та електролітів. Механічно ці реабсорбційні функції досягаються роботою багатьох мембранних транспортерів та каналів, специфічних для води, глюкози, амінокислот, натрію, хлориду, бікарбонату та інших біомолекул на верхівкових та базолатеральних поверхнях REC, використовуючи клітинний АТФ як остаточне джерело енергії . Відповідно, REC є щільно заповненими мітохондріями і залежать від мітохондріального OxPhos та FAO для отримання енергії для підтримки їх реабсорбційних функцій. Однак залишається недостатньо зрозумілим, як метаболізм мітохондрій координується з реабсорбційними функціями нирок, і як дисфункція мітохондрій сприяє захворюванню нирок.

Недавня робота показала, що пов'язаний з ядерними рецепторами естроген гамма-рецептор (ERRγ) є критичним транскрипційним регулятором мітохондріального OxPhos та FAO (13 ⇓ –15). Дослідження з використанням специфічних для клітин типів мишей ERRγ KO обійшли перинатальну летальність мишей ERRγ KO всього тіла та надали остаточні докази суттєвої ролі ERRγ у нейрональному метаболізмі та навчанні/пам'яті, серцевому метаболізмі та скороченні/провідності, функціональному дозріванні підшлункової залози клітини, термогенна функція адипоцитів коричневого кольору та визначення типу та функції волокон скелетних м’язів (16 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –22). Геномні дослідження показують, що ERRγ безпосередньо пов'язує і активізує транскрипцію сотень генів, важливих для мітохондріального OxPhos в нейронах, і OxPhos, FAO та генів скорочення серця в клітинах серця (17, 23). Крім того, ERRγ сильно експресується в нирках і є важливим для нормального розвитку ембріональної нирки (24). Зокрема, генетичні дослідження на людях виявляють, що взаємна транслокація de novo за t (1, 2) (q41; p25.3) із залученням локусу ERRγ пов’язана з двостороннім агенезісом нирок/гіпоплазією/дисплазією (25).

Тут ми генерували мишей REC-ERRγ KO і показуємо, що у них розвивається ниркова мітохондріальна та реабсорбційна дисфункція. Геномні дослідження показують, що ERRγ регулює метаболізм мітохондрій та реабсорбцію нирок за допомогою різних механізмів: хоча ERRγ сам по собі регулює функції мітохондрій OxPhos/FAO, ERRγ співпрацює з HNF1β для активації експресії генів реабсорбції нирок. Крім того, пацієнти з ХХН демонструють знижену експресію ERRγ у нирках і мають спільні ниркові транскрипційні сигнатури з мишами REC-ERRγ KO. Разом ці результати розкривають механізм скоординованої регуляції функції мітохондрій та реабсорбції нирок та визначають передачу сигналів ERRγ як важливу ланку до дисфункції мітохондрій, пов’язаної із захворюваннями нирок.

Результати

Втрата ERRγ в RECs призводить до захворювання нирок з кістами.

Спочатку ми визначили, де ERRγ експресується в постнатальних нирках, проаналізувавши гетерозиготний штам ERRγ миші, в якому LacZ потрапляв у локус ERRγ (16). Фарбування за допомогою X-gal показало, що ERRγ був високо і специфічно виражений у РЕЦ всіх сегментів канальців та збірних проток, але ледь помітний у будь-яких інших клітинах, включаючи клітини в клубочках (Додаток SI, рис. S1A). Крім того, білок ERRγ був виявлений виключно в ядрі, але не в мітохондріях або цитозолі, відповідно до його функції як фактора транскрипції ядер (додаток SI, рис. S1B).

Щоб визначити важливість ERRγ у постнатальній біології та захворюваннях нирок, ми генерували мишей REC-ERRγ KO шляхом схрещування мишей, що містять флоксирований алель ERRγ (17) із штамом Sim1-Cre. Сильна ниркова експресія Cre відбулася при народженні і призвела до швидкої постнатальної втрати експресії ERRγ нирки, лише до 15 тижнів віку залишилось лише 15% мРНК ERRγ (додаток SI, рис. S1C). За допомогою подвійного флуоресцентного штаму миші-репортера (26) ми також виявили, що ця лінія Sim1-Cre опосередковує рекомбінацію, особливо у всіх сегментах канальця та збирає епітелій протоки в нирках (Додаток SI, рис. S1D), саме там, де ERRγ зазвичай виражається (Додаток SI, рис. S1A). Для всіх подальших досліджень ми використовували як мишей REC-ERRγ KO, так і жінок.

Як миші REC-ERRγ KO, так і самки (Cre +) народились і вижили перинатально при очікуваному співвідношенні Менделя. Їх нирки мали нормальну вагу та гістологічний вигляд при народженні та у віці 3 тижнів, що свідчить про відсутність вад розвитку (рис. 1 A – C). Відповідно до гістологічних спостережень електронна мікроскопія показала, що ультраструктура нирок, включаючи мітохондрії в клубочках, проксимальних канальцях та дистальних канальцях, була порівнянна з контролем у віці 3 тижнів (Додаток SI, рис. S2). Однак згодом і у самців, і у самок мишей REC-ERRγ KO розвинулись прогресуючі порушення функції нирок (рис. 1А). Нирки мишей REC-ERRγ KO були значно важчими, ніж контролі, до віку 1 міс і втричі важчі до віку 3 міс (рис. 1 B і D). Гістологічне дослідження показало, що нирки мишей REC-ERRγ KO містять безліч кіст, наповнених рідиною змінних розмірів (рис. 1E), що призводить до порушення загальної організації та структури нирок. Гломерули були присутніми і здавались гістологічно нормальними на основі фарбування H&E. Багаті вуглеводами базальні мембрани клубочків, включаючи капілярні петлі, що відповідають за функцію ниркової фільтрації, також залишались цілими, як оцінювали періодичним фарбуванням кислотою-Шиффом (рис. 1Е). Ці результати свідчать про те, що ERRγ є критично важливим для підтримання нормальної структури та функції нирок in vivo.

У мишей REC-ERRγ KO розвивається хвороба нирок із наповненими рідиною кістами. (A та B) Репрезентативні зображення (A) та вага (B) контрольної та REC-ERRγ KO нирок у різному віці (n = 12–19). (C) Тритижневий контроль та морфологія нирок REC-ERRγ KO. (Зверху) пляма H&E. (Шкала шкали, 1000 мкм.) (Середня) пляма H&E. (Шкала шкали, 100 мкм.) (Внизу) Плями періодичної кислоти-Шиффа (Шкала шкали, 100 мкм.) Наконечники стрілок вказують на клубочки. (D) Нирки (червоні стрілки) 3-місячних контрольних та REC-ERRγ KO мишей, що ілюструє їх відносні розміри до тіла. (E) Тримісячний контроль та морфологія нирок REC-ERRγ KO. Смуги фарбування та накипу такі ж, як у C. Смужка помилок вказує на SEM. * P - і Cre + за t-тестом. Були включені як миші, так і самки.

ERRγ безпосередньо регулює метаболічну та реабсорбційну функції мітохондрій.

ERRγ має важливе значення для підтримки нормальної експресії метаболічних та ниркових реабсорбційних генів мітохондрій REC. (А) Ділянка вулкана, що показує гени, диференційовано експресовані у 3-тижневих контрольних та REC-ERRγ KO нирках за допомогою РНК-Seq (n = 4). Критерієм фільтрації є зміна кратності> ± 1,5 та P - та Cre + за t-тестом. Були включені як миші, так і самки.

Далі ми досліджуємо, чи зміни ниркової транскриптоми у мишей REC-ERRγ KO залежать від статі. Як у самців, так і у жінок REC-ERRγ KO миші виявляли подібні зміни шляху як для регульованих вниз, так і вгору генів (Додаток SI, рис. S3B). Це узгоджується з тим фактом, що у обох статей мишей REC-ERRγ KO розвивається хвороба нирок. Щоб визначити, чи зберігаються ці молекулярні дефекти мітохондріальних та ниркових функцій на пізній стадії захворювання нирок, ми провели RNA-Seq-аналіз у 3-місячних самців контрольних і REC-ERRγ KO мишей та порівняли його з даними RNA-Seq 3 -wk-старі самці мишей. Всі знижені та більшість регульованих вгору клітинних шляхів підтримувались у 3-місячних мишей REC-ERRγ KO (додаток SI, рис. S3C). Кілька додаткових регульованих клітинних шляхів були знайдені у віці 3 місяців, що, ймовірно, відображало вторинні зміни на пізній стадії захворювання нирок.

Далі ми дослідили, чи порушені метаболізм мітохондрій та функція реабсорбції нирок у мишей REC-ERRγ KO. Встановлено, що ферментативна активність комплексів мітохондріальних електронних транспортних ланцюгів знижується у 3-тижневих нирках REC-ERRγ KO (рис. 3А), що узгоджується з їх зниженою експресією РНК. Крім того, вміст мтДНК значно зменшився (рис. 3В), незважаючи на нормальні ультраструктури мітохондрій, що вказує на дисфункцію мітохондрій. Важливо, що всі ці мітохондріальні метаболічні дефекти були присутні у віці 3 тижнів, перш ніж спостерігалися будь-які морфологічні або функціональні ниркові дефекти, що свідчить про те, що мітохондріальна дисфункція є генезом ниркових дефектів у мишей REC-ERRγ KO.

ERRγ співпрацює з HNF1β для регулювання транскрипції ниркових реабсорбційних генів. (A) Топ 5 мотивів de novo біля піків ERRγ ChIP-Seq. (B) Перекриття ниркових піків ERRγ та HNF1β ChIP-Seq. Вісь - теги log2/10 7 прочитань. (C) 10 найкращих шляхів генів, анотованих до піків ERRγ та/або HNF1β ChIP-Seq. (D) Репрезентативні піки ERRγ та HNF1β ChIP-Seq. вісь y - значення піку. Однакова шкала для контрольних та ERRγ KO RNA-Seq треків. (E) Зв’язування ERRγ та/або HNF1β поблизу генів OxPhos, FAO та нирок для реабсорбції за допомогою ChIP.

ERRγ та HNF1β функціонально співпрацюють для регулювання нирок реабсорбції нирок.

Функціональна співпраця між ERRγ та HNF1β у регуляції функції нирок. (A) HNF1β ChIP-ERRγ reChIP-Seq та аналіз даних. (B) Atp1b1 пов'язаний ERRγ і HNF1β в тих самих клітинах за допомогою ChIP-reChIP-qPCR. (C) Посилена активація експресії Atp1b1 як ERRγ, так і HNF1β.

Потім ми дослідили, чи функціонують ERRγ та HNF1β для регулювання транскрипції генів реабсорбції нирок. Ми не змогли виявити фізичну взаємодію між ERRγ та HNF1β у лізатах клітин нирок або нирок миші, використовуючи коімунопреципітацію з подальшим вестерн-блот (додаток SI, рис. S5D). Це свідчить про те, що вони або не взаємодіють безпосередньо, або їх взаємодія недостатньо сильна, щоб бути виявленою цим методом, як повідомлялося раніше у випадках прив'язки фактора транскрипції (36). Експресія пов'язаних генів ERRγ та HNF1β, таких як Atp1b1, активувалася або ERRγ, або HNF1β, і додатково зростала як за допомогою ERRγ, так і HNF1β (рис. 5C). Разом ці результати дозволяють припустити, що ERRγ і HNF1β функціонально співпрацюють для регуляції генів реабсорбції нирок.

Пацієнти з ХХН демонструють знижену експресію ERRγ у нирках та діляться сильно перекриваються нирковими транскрипційними підписами на мишах REC-ERRγ KO.

Щоб порівняти ці результати ERRγ із захворюваннями нирок людини, окрім вроджених розладів (25), ми виміряли експресію ERRγ у нирках у 95 зразках канальців нирок людини у пацієнтів з ХХН та контрольними когортами. Ми виявили, що експресія ERRγ позитивно корелювала зі швидкістю клубочкової фільтрації (ШКФ), добре встановленим клінічним індексом функції нирок (рис. 6А). Крім того, експресія ERRγ у нирках була значно знижена у пацієнтів із ХХН (ШКФ 60; рис. 6В). Далі ми порівняли транскриптоми нирок між мишами REC-ERRγ KO та пацієнтами із ХХН (12). Близько 25% регульованих вниз та 19% генів, що регулюються вгору, у мишей REC-ERRγ KO були розподілені у пацієнтів з ХХН (рис. 6 C та D). Існує значне перекриття уражених шляхів між мишами REC-ERRγ KO та пацієнтами-людьми з ХХН. Зокрема, регульовані шляхи зниження майже ідентичні у мишей та людей і включають безліч функцій мітохондрій та шляхи реабсорбції нирок, які регулюються ERRγ. Ці результати свідчать про широку та критичну роль ERRγ при захворюваннях нирок людини.

У пацієнтів із ХХН спостерігається зниження експресії ERRγ у нирках та частка мишків транскрипції нирок, що сильно перекриваються, з мишами REC-ERRγ KO. (A) Експресія ERRγ позитивно корелює з ШКФ у 95 зразках канальців нирок людини за кореляцією Пірсона. (B) Експресія ERRγ значно зменшується в канальцях нирок ХХН людини за допомогою t-тесту. (C і D) Порівняння діаграми Венна та теплової карти найзбагаченіших шляхів генів нирок з регульованою вниз (C) або вгору (D) нирками між 3-тижневими мишами REC-ERRγ KO та пацієнтами з ХХН. Статистичний аналіз проводили за допомогою точного критерію Фішера. (E) Модель, яка ілюструє, що ERRγ координує енергогенеруючі мітохондріальний метаболізм та енергоємні функції реабсорбції нирок за допомогою різних механізмів.

Обговорення

Матеріали та методи

Усі дослідження на мишах були схвалені та виконувались згідно з керівництвом Інституційного комітету з догляду та використання тварин дитячої лікарні Філадельфії. Аденовіруси генерувались, як описано раніше (39, 40). Трансмісійна електронна мікроскопія, експресія генів, вестерн-блот, клітинне вимірювання споживання кисню, мітохондріальна ДНК та аналіз активності ферментів проводили, як описано раніше (18, 41). Будь ласка, дивіться Додаток SI, Матеріали та методи SI для детального опису досліджень на мишах, культури клітин, поглинання глюкози, гістологічного аналізу, експериментів з РНК-Seq, ChIP-Seq та ChIP-reChIP-Seq. Статистичний аналіз проводили за допомогою t-критерію Стьюдента, кореляції Пірсона або точного критерію Фішера. Дані мікрочипів були депоновані в базі даних ArrayExpress (E-MTAB-2502). Дані RNA-Seq, ChIP-Seq та ChIP-reChIP-Seq були депоновані в базі даних GEO (GSE104907).

Подяки

Ми вдячні доктору Дугласу Уоллесу, доктору Мітчелу Лазару, доктору Метью Вейцману, доктору Аміті Сегал, доктору Майклу Марксу та доктору Марку Кан за критичне обговорення проекту. Ми вдячні доктору Бяо Цуо, доктору Рей Міду та лабораторії ресурсів лабораторії електронної мікроскопії UPenn за технічну підтримку. Автори та ця робота були підтримані Управлінням помічника міністра оборони з питань охорони здоров’я за допомогою Програми медичних досліджень, що проводиться експертами в рамках премії W81XWH-16-1-0400, та пілотних нагород Центру досліджень діабету при Університеті Пенсільванії від грант, спонсорований NIH (DK19525; DK111495 - LP; DK099379 - BJW; DK108987 - GDB; і DK087635 і DP3 DK108220 - KS).

Виноски

  • ↵ 1 Кому слід адресувати листування. Електронна адреса: lpeipennmedicine.upenn.edu .