Дослідження щодо запобігання зараженню сальмонелою шляхом використання агрегаційних характеристик молочнокислих бактерій

Анотація

Сальмонела - одна з основних патогенних бактерій, що викликають харчові отруєння. У цьому дослідженні було досліджено, чи захищає тепло, а також живий лактобактерій тварину-господаря від зараження сальмонелою. Живий та тепловий вбитий Lactobacillusacidophilus вводили перорально щурам Sprague-Dawley протягом 2 тижнів до того, як щурам прищепили сальмонелу. Підвищення температури тіла було помірним у групі, яка отримувала бактерії, що вбивали тепло, порівняно з контрольною групою сальмонел. Середня кількість споживання корму та споживання води для кожної щури у групі бактерій, що вбивались, була майже нормальною. Кількість фекальних сальмонел було порівнянним між живими та вбитими жаром групами L. acidophilus. Цей висновок показує, що L. acidophilus сприяє виведенню сальмонели. Більше того, рівні прозапальних цитокінів, включаючи фактор некрозу пухлини (TNF) -альфа та інтерлейкін (IL) -1 бета, у групі, що вбивалась теплою L. acidophilus, були значно нижчими порівняно з рівнями у контрольній групі сальмонел. Ці результати вказують на те, що нежиттєздатні молочнокислі бактерії також можуть зіграти важливу роль у запобіганні зараженню кишковими збудниками, такими як сальмонела.

ВСТУП

Сальмонела - це кишковий бактеріальний збудник і основна патогенна бактерія, яка викликає харчові отруєння. Шляхи зараження включають заражену їжу та воду. Сальмонела є грамнегативною паличкою, викликає паратиф, гематосепсис та гастроентерит як збудників харчових отруєнь (1,2), і ці збудники часто протистоять антибіотикам, таким як тетрациклін, триметоприм-сульфаметоксазол та стрептоміцин (3,4). Відомо, що сальмонела має близько 2500 серотипів, включаючи найчастіше зустрічаються тифи та тифімурій. Тифі - це серотип сальмонели, який викликає сальмонельоз у людей. Salmonella typhimurium, яка була використана в цьому дослідженні, викликає сальмонельоз у мишей, тому це корисний штам, який часто зустрічається при бактеріальних інфекціях у тварин (5).

В імунній системі макрофаг відповідає за імунні реакції, включаючи вроджені та адаптивні імунні реакції проти інфекцій у всіх захисних системах господаря. Коли патоген наближається до епітеліального бар’єру, макрофаг продукує цитокіни для індукції фагоцитозу, такого як фактор некрозу пухлини (TNF) -альфа (6). Зокрема, TNF-альфа відіграє важливу роль у імунних реакціях господаря та грамнегативних бактеріальних інфекціях (7). Він також використовується як важливий параметр на тваринних моделях зараження сальмонелою. Відомо, що рівень TNF-альфа у немовлят, інфікованих сальмонелою, високий (8).

Дослідження інгібування сальмонели з використанням молочнокислих бактерій (LAB) часто зосереджувались на таких предметах: лікування харчових отруєнь з використанням бактеріоцину, який інгібує патогени (9), імунітет, набутий завдяки імунологічним зв'язкам між LAB та клітинами кишкового епітелію (10), та лікування або профілактика харчових отруєнь шляхом інгібування проживання патогенів у товстій кишці шляхом коагрегації, аутоагрегації, адгезії кишкових клітин та бактеріальної адгезії до тестів на вуглеводні.

У цьому дослідженні проводили коагрегацію живих та теплових вбитих (hk) LAB з використанням гідрофобності, і LAB з найкращою здатністю до коагрегації були обрані для дослідження профілактики зараження сальмонелою на тваринній моделі.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Препарат LAB та S. typhimurium. Для лабораторної лабораторії Lactobacillus acidophilus 11869BP, який використовувався і перорально вводився один раз на два дні у цьому дослідженні, був культивований у компанії CELLBIOTECH Co. Ltd. (Gimpo, Корея). LAB інокулювали в бульйон MRS (Difco, Детройт, Мічиган, США) і культивували при 37 ℃ протягом 18

24 години, а потім двічі промивають стерильним фізіологічним розчином для видалення будь-яких метаболічних речовин, пов’язаних із цим. Потім його вбили автоклавуванням при 121 ℃ протягом 15 хв. перед використанням розчин hk LAB висушили ліофільно та розчинили у фізіологічному розчині (12). Salmonella typhimurium is NCCP 10725 використовували протягом цього дослідження. Цей культивований штам, культивований (при 200 об/хв) в інфузійному відварі серця мозку (Difco, Детройт, Мічиган, США), протягом 18-24 годин при 37 ℃ в аеробних умовах, збирають центрифугуванням (3200 × g, 4 ℃, 20 хв), після чого його піддавали струшуванню - один раз культивували в однотипних свіжих середовищах.

Клітинні культури. Клітинні лінії аденокарциноми товстої кишки людини HT-29 (KCLB 30038; Сеул, Корея) культивували в RPMI1640, які доповнювали 10% плодовою бичачою сироваткою (FBS; HyClone, Logan, UT, США) та пеніциліном/стрептоміцином 1% (Invitrogen, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Клітини культивували при 37 ℃ в атмосфері 5% СО2 та 95% повітря.

Тест in vitro на здатність коагрегації. Аналіз коагрегації проводили згідно з Handley et al. (13). Для вимірювання здатності коагрегації LAB живих та hk бактерій та сальмонели кожну ОД бактерій LAB та сальмонели готували при 0,5. А суміші Salmonella typhimurium та живих або hk бактерій LAB культивували протягом двох годин для вимірювання їх рівня OD (14). Потім здібності коагрегації вимірювали за допомогою наступного рівняння.

A: поглинання при 600 нм, соль: Salmonella typhimurium, лак: lactobacillus acidophilus

Аналіз адгезії. Аналіз адгезії проводили, як описано у Jacobsen et al. (15). Кожна лунка 12-лункової пластини для культури тканин була засіяна клітинами НТ-29. 500 мкл DMEM без сироватки та антибіотиків додавали до кожної лунки та інкубували при 37 ℃, CO2 5% протягом 1 години. Пробіотики та S. typhimurium вирощували протягом ночі культури бактерій, відповідно розбавляли (10 ×) DMEM, отримуючи концентрацію бактерій приблизно 10 8 клітин/мл. Одночасно додавали сальмонелу та живу або hk LAB протягом 1 години інкубації. Після інкубації протягом 1 години всі посуди тричі промивали сольовим розчином, забуференним фосфатом, для вивільнення незв’язаних бактерій. А потім лунку фарбують набором для фарбування грам (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія, США) і спостерігають за мікроскопом (× 1000).

Дослідні тварини. Вісім тижнів білих самців щурів Sprague-Dawley були придбані у компанії Orient Bio (Соннам, Корея). Їх саджали в клітини групами по п’ять. Протягом тижневого періоду адаптації щурів спонукали вільно приймати корми пелетного типу та воду в умовах температури 24 ± 2 ℃, відносної вологості 40 ± 20% та 12-годинного циклу освітлення. Поки відстежували стан їх здоров’я, їх кал культивували на тарілці Salmonella-Shigella (Difco, Детройт, Мічиган, США) із селективними середовищами S. typhimurium, перш ніж неінфікованих щурів відбирали за допомогою скринінгового процесу.

Пероральне введення LAB. Для дослідження інгібуючих ефектів перорального введення LAB на патогенну проліферацію бактерій було підготовлено шість експериментальних груп, як показано в таблиці 1, і дев'ять щурів були призначені для кожної групи. Всю групу лікували з метою порушення початкової флори кишечника за допомогою антибіотичного процесу (ампіцилін: 4 г/л) протягом трьох днів. А потім L. acidophilus live і готували бактерії hk. Починаючи за два тижні до введення патогенних бактерій, 1 × 10 9 та 1 × 10 10 КУО по 1 мл LAB перорально вводили щурам щодня протягом тижня.

Таблиця 1.

Створення експериментальних груп на основі введення пробіотиків

Групи Умова прийому Лікування пробіотиками

NC	Неадміністрація	-
SA	Не введення, після щеплення збудника	-
L.1.0E + 9	Попереднє введення, щодня за 2 тижні до щеплення збудника	жити 10 9 КУО
L.1.0E + 10	Попереднє введення, щодня за 2 тижні до щеплення збудника	жити 10 10 КУО
hk.1.0E + 9	Попереднє введення, щодня за 2 тижні до щеплення збудника	теплові вбивства 10 9 КУО
hk.1.0E + 10	Попереднє введення, щодня за 2 тижні до щеплення збудника	теплові вбивства 10 10 КУО

Маса тіла і температура тіла. Після однотижневого періоду адаптації щурам вводили LAB і вимірювали масу тіла щотижня. До (0 год) та після (24 год) індукованої сальмонелою діареї вимірювали масу тіла щурів, щоб підтвердити їх зміни. Температуру тіла щурів вимірювали до (0 год) і після (1, 3, 6, 9, 12 та 24 год) діареї, викликаної сальмонелою, за допомогою тваринного ректального термометра для підтвердження змін.

Вимірювання споживання корму та споживання води. Перед пероральним введенням сальмонели було підтверджено кількість споживання їжі та води кожного щура. Для порівняння кількості споживання корму до та після діареї, інфікованої сальмонелою, кількість корму була обмежена до 200 г на день. Також кількість води також було обмежено до 500 мл на день.

Кількість живих бактерій сальмонели. Для підтвердження розповсюдження патогенних бактерій кал експериментальних тварин асептично відбирали у метаболічній клітці протягом 24 годин. Один грам калу кожної групи щурів гомогенізували в 9 мл сольового розчину і послідовно розводили 10 разів PBS. Після гомогенізації фекальні речовини послідовно розводили і висівали на агар МакКонкі (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія, США). Агарові пластинки інкубували при 37 ℃ протягом 24 годин і бактерії зараховували як КУО/г калових речовин. Морфологія колонії сальмонел у чистій культурі та інфікованих фекаліях була подібною (16).

Аналіз на цитокіни. Через три години після перорального введення патогенної бактерії S. typhimurium проби крові відбирали з орбіт щурів. Зібрані зразки крові залишали при кімнатній температурі на дві години, а потім центрифугували (4 ℃, 1500 × g, 15 хв) для відділення сироватки. Зразки тримали при -80 ℃ до проведення аналізу на цитокіни. Сироватку розморожували для аналізу цитокінів у сироватці крові, а прозапальний цитокін TNF-alpha та IL-1beta (R&D Systems, Міннеаполіс, Міннесота, США) підтверджували за допомогою ІФА. Його вимірювали за допомогою приладу i-Mark (Bio-Rad Laboratories, CA, USA).

Мікроскопічне спостереження. Для підготовки зразків кишечника до патологічного дослідження тканину кишечника вирізали, фіксували у 10% формаліні протягом 24 годин і промивали водою. Тканина зневоднювалась у спирті (протягом 1 години кожен у 70, 80, 90 та 100%) та ксилолі (3 етапи, 1 година у кожному етапі) та вкладався у парафін. Парафіновий блок нарізали товщиною 7 мкм, фарбували гематоксилін-еозином (H&E) (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США), а потім знову фарбували набором для фарбування грамів (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія, США ) і спостерігається за допомогою мікроскопа (× 1000).

36,7 мл споживання очищеної води, що було менше, ніж у групі SA (рис. 4 B).

ОБГОВОРЕННЯ

Найбільш серйозною проблемою лікування сальмонельозу антибіотиками є вторинні пошкодження, спричинені мертвою сальмонелою (17). Стійка до антибіотиків сальмонела створює ще одну проблему (18). Щоб подолати ці проблеми, антибіотики слід використовувати обережно, а на додаток до видалення сальмонели слід подолати вторинні пошкодження мертвої сальмонели. У цьому дослідженні ефективність ЛАБ, що відповідала вищезазначеним умовам у пригніченні та виведенні сальмонели, була підтверджена для профілактики та лікування сальмонели за допомогою ЛАБ.

При дослідженні кількості споживання корму кількість у групі SA різко зменшилася. Цей результат збігся з результатом попереднього дослідження (19). У випадку груп LAB живих та hk бактерій зменшення кількості споживання корму було незначним, залишаючись майже на тому ж рівні, що і нормальна група. Згідно з дослідженням Wang et al. у 1993 р. (20) кількість споживаної води після прийому сальмонели зросла через вплив ендотоксинів сальмонели (20). У цьому дослідженні кожна щур групи SA брала 39,3 мл води, тоді як кожна щур групи сальмонели та hk (10 10) LAB брала 32,6 мл, що підтверджує нормалізацію кількості споживання води після зараження сальмонелою. Цей результат вказує на те, що бактерії LAB hk видаляють сальмонелу та майже побічні продукти сальмонели завдяки коагрегаційним властивостям, тому збільшення кількості споживання води було порушено.

Найбільш помітним результатом цього дослідження стала різниця в кількості живих бактерій сальмонели у фекаліях живої та hk-груп LAB. У попередніх дослідженнях ріст сальмонели в умовах кислотного стресу молочної кислоти пригнічувався (21). У цьому дослідженні фекальні живі бактерії сальмонели в групі лікування живими бактеріями LAB були більш суттєво пригнічені, ніж у групі SA. Це може бути пов’язано з L. acidophilus, який був використаний у цьому дослідженні, що виробляє молочну кислоту для зміни рН кишечника та пригнічення проліферації сальмонели. В результаті спостереження за зміною кількості фекальних живих бактерій сальмонели в групі лікування бактеріями LAB hk, велика кількість сальмонел вижила в калі. Вважалося, що сальмонели, які залишились у кишечнику, виводились через агрегацію hk LAB. Як вже зазначалося, стійкість до антибіотиків при лікуванні сальмонелою та ендотоксини сальмонели вважається подоланою.

Для дослідження рівня запалення у щурів після прийому сальмонели порівнювали їх рівень TNF-альфа в сироватці крові. Рівень TNF-альфа групи LAB живих та hk бактерій значно суттєвіше знизився, ніж у групі SA. Особливо, у 10 10 живої та hk групи LAB показали зниження рівня, ніж у 10 9 LAB групі. Згідно з попереднім дослідженням у клінічному дослідженні з використанням Lactobacillus GG, введення LAB сприяло посиленню експресії рецепторів, які брали участь у імунологічному посиленні (22). Вважалося, що LAB, які вводили тваринам, сприяли імунологічному посиленню кишечника та інгібуванню підвищення рівня запального цитокіну TNF-альфа у разі зараження сальмонелою. Тому живі бактерії вважалися більш тісно пов’язаними з кишковою імунною системою, ніж бактерії hk.

Підводячи підсумок, коли LAB живі та hk бактерії порівнювали з точки зору їх профілактики зараження сальмонелою, було підтверджено, що група живих бактерій групи LAB 10 9 відзначилася контролем рівня експресії сироваткового TNF-альфа та IL-1бета, які відомі як репрезентативний запальний цитокін; а в групі LAB 10 10 рівні живих та hk бактерій були подібними. Це було пов'язано з тимчасовим збільшенням імунологічного посилення після введення живих бактерій LAB; і коли вводили більше LAB, відбулося подібне імунологічне посилення. У попередньому дослідженні повідомлялося, що ендотоксини сальмонели викликали спрагу у щурів (20). Таким чином, група сальмонел, яка, як передбачалося, мала найбільшу кількість ендотоксинів сальмонели, повідомила про найбільшу кількість споживання води, тоді як група сальмонел та LAB показала зменшення кількості. Враховуючи значне зменшення споживання води, особливо у групі hk LAB, зменшена спрага, спричинена LPS, була більш ефективною у групі бактерій LAB hk.