Дієта після відлучення впливає на мікробний склад фекалій, але не виділена експресія жирового гена у кота (Felis catus)

Affiliation Food Nutrition & Health, AgResearch Grasslands, Palmerston North, New Zealand

Affiliation Animal Nutrition & Health, AgResearch Grasslands, Palmerston North, New Zealand

Affiliation Food Nutrition & Health, AgResearch Grasslands, Palmerston North, New Zealand

Афілійований відділ харчових наук, Університет Іллінойсу в Урбана-Шампейн, Урбана, Іллінойс, Сполучені Штати Америки

Відділ харчових наук, Університет Іллінойсу в Урбана-Шампейн, Урбана, штат Іллінойс, Сполучені Штати Америки, Департамент наук про тварин, Університет Іллінойсу в Урбана-Шампейн, Урбана, Іллінойс, Сполучені Штати Америки

Affiliations Food Nutrition & Health, AgResearch Grasslands, Palmerston North, New Zealand, The Riddet Institute, Massey University, Palmerston North, New Zealand

Партнерський центр котячого харчування, Інститут харчування, харчування та здоров'я людини, Університет Массі, Палмерстон-Норт, Нова Зеландія

Емма Н. Бермінгем,
Сандра Кіттельманн,
Уейн Янг,
Кетрін Р. Керр,
Келлі С. Суонсон,
Ніколь К. Рой,
Девід Г. Томас

Цифри

Анотація

Вплив до- (тобто вагітності та під час лактації) та дієти після відлучення на склад фекальних бактеріальних спільнот та жирову експресію ключових генів у шляхах глюкози та інсуліну досліджували у котів. Маток підтримували на помірному вмісті білка: жир: вуглеводи, що подрібнювались (“Дієта А”; 35: 20: 28% СД; n = 4) або з високим вмістом білка: жир: вуглеводні консерви (“Дієта В”; 45: 37: 2% СД; n = 3) дієта протягом всієї вагітності та лактації. Потомство було відлучено від цих дієт у вкладеному дизайні (n = 5 на лікування). Зразки фекалій були зібрані у віці 8 та 17 тижнів. ДНК виділяли з фекалій, а бактеріальні амплікони гена 16S рРНК аналізували піросеквенуванням. РНК виділяли з крові (тиждень 18) та жирової тканини та тканин яєчників/яєчок (тиждень 24) та рівні експресії генів, визначені за допомогою RT-qPCR. Відмінності (P Таблиця 1. Профіль макроелементів комерційно доступної Асоціації американських службовців контролю за кормами (AAFCO), перевірених кормом дієт, що годуються домашніми кошенятами з короткою шерстю (Felis catus).

Тварини та житло. Вісім маток (виведені з 3 неспоріднених томів; середній вік 5,3 ± 0,4 року) були випадковим чином віднесені до однієї з двох дієт (n = 4 на дієту). Матки отримували або дієту A, або дієту B ad libitum протягом усього дослідження (таблиця 1). Кожну матку спарювали з одним непов’язаним самцем, який годувався або Дієтою А, або Дієтою В. Після підтвердження вагітності (приблизно 7-8 тижнів вагітності) маток переселяли в окремі багатошарові клітини для засвоюваності, що містили гніздові коробки на верхній поличка [23]. За тиждень до народження зразки фекалій збирали протягом 15 хв після дефекації, заморожували в рідкому азоті і зберігали при –85 ° C до аналізу.

Всього народилося двадцять кошенят, яких зважували протягом 24 годин (год) після народження та через день протягом 2 тижнів (тиждень), а потім з інтервалом в тиждень до кінця дослідження.

З тижня від 0 до 4 всі кошенята отримували молоко виключно від своєї дамби. Половина кожного посліду була випадковим чином розподілена (в межах статі) на дієту А, а половина на дієту Б, утворюючи чотири групи дієтичного лікування (А-А, А-В, В-В, В-А; Таблиця 2). У віці 4 тижнів кошенят поступово відлучували від твердої їжі, отримуючи як відповідну тверду їжу, так і молоко до 8 тижнів, коли кошенят повністю відлучили. Під час процесу відлучення (4 тижні далі) кошенят утримували у групі відповідно до дієти після відлучення для їжі та соціалізації, повертаючись до своєї дамби лише для доступу до молока. До 8 тижнів кошенят утримували виключно відповідно до їх дієти після відлучення. Дієта та вода були доступні щоденно, щоб забезпечити нормальний ріст (рис. 1).

Дані подаються як середні значення ± SEM.

Дієта перед відлученням визначається як поєднані наслідки гестації та лактації та раннього відлучення, а фаза після відлучення - точка, коли кошеня більше не отримує молока від матері.

Вибірка фекалій та підготовка ампліфікації штрих-коду бактеріальних генів 16S рРНК та об'єднання ампліконів. У віці 8 та 17 тижнів кошенят утримували індивідуально протягом 24 годин, а свіжу пробу фекалій збирали протягом 15 хв після виведення, заморожували в рідкому азоті та зберігали при –85 ° C.

Експресія гена тканини. У віці 18 тижнів відбирали зразок крові (0,5 мл) і екстрагували РНК, використовуючи Total RNA Minikit (Кров/культивовані клітини) від Geneaid® (DNature, Gisborne, NZ) відповідно до інструкцій виробника. У віці 24 тижнів під час кастрації відбирали зразки тканин яєчників (тільки для жінок), тканин яєчок (тільки для чоловіків) та тканин черевної порожнини (лише для жінок). Зразки тканини промивали в крижаному сольовому розчині, а потім занурювали в RNAlater® на ніч, потім зберігали при –20 ° C до аналізу. РНК виділяли з черевного жиру та репродуктивних тканин за допомогою універсального міні-набору RNeasy Plus (QIAGEN Pty Ltd, VIC 3148, Австралія) відповідно до інструкцій виробника.

Експресія синтази жирних кислот (FASN), транспортера глюкози 1 (GLUT1) та 4 (GLUT4), рецептора інсуліну (INSR), лептину (LEPT), гормоночутливої ліпази (LIPE), роз'єднуючого білка 2 (UCP2), субстрату рецептора інсуліну 1 (IRS-1) та 2 (IRS-2), інгібітор активатора плазміногену-1 (PAI-1), проліферативний активований рецептор пероксисоми-γ (PPARG) визначали у зразках крові та тканин за допомогою RT-qPCR, як описано раніше [6], [14], [28], [29]. Коротко кажучи, загальна РНК була транскрибована за допомогою наборів РНК-кДНК Applied Biosystems високої ємності (Applied Biosystems Inc., Фостер-Сіті, Каліфорнія) та rt-qPCR на термоциклері Rotor-Gene 6000 (Qiagen). Експресія FASN, GLUT1, GLUT4, INSR, IRS1, IRS2, LEPT, LIPE, PAL-1, UCP2 та PPARG були нормалізовані щодо експресії GAPDH.

Криві розрідження, засновані на індексі різноманітності Chao1 (при 97% відрізку ідентичності послідовності), вказують на те, що фекальні бактеріальні спільноти котів, які харчуються дієтою A (---; n = 3 коти), були менш різноманітними, ніж коти, які годували дієтою B ( -; n = 4 коти). Дані подаються як середні значення ± SEM.

Вплив дієти перед відлученням на фекальні спільноти бактерій у кошенят

Дієта перед відлученням не впливала на частку філи у фекаліях кошенят (табл. 4), проте пропорції деяких таксонів були змінені (табл. 5). У кошенят від матерів, що годувались раціоном А, спостерігалося збільшення кількості солобактерій, пептококкацеа та клостридіалів та клостридій (табл. 5), а також зменшення чисельності мегамонасів та алісонел (табл. 5).

Вплив форма дієти після відлучення на склад фекальних бактеріальних спільнот кошенят

Не було виявлено впливу віку відбору проб на популяції мікробів (8 або 17 тижнів, дані не наведені), тому результати цих двох періодів були об’єднані. У кошенят на різноманітність бактеріальної популяції впливала дієта після відлучення (рис. 3). Основний координаційний аналіз (PCoA) зважених та незважених філогенетичних відстаней Unifrac показав, що загальна структура спільноти мікробіоти була найбільш схожою між нащадками, яких годували однаковою дієтою після відлучення, незалежно від дієти матері (рис. 4 та 5). Багатофакторний аналіз показав, що дієта після відлучення мала значний вплив на склад спільноти (P Рисунок 3. Вплив годування дієтою A або Diet B до і після відлучення на різноманітність мікробів у фекаліях кошенят (Felis catus).

Криві розрідження, засновані на індексі різноманітності Chao1 (при 97% відрізку ідентичності послідовності), вказують на те, що фекальні бактеріальні спільноти кошенят, яких годували дієтою B (AB і BB; n = 10), були більш різноманітними, ніж ті, що годували дієтою A (AA і BA, n = 10). Дієта перед відлученням не впливала на різноманітність кошенят у громаді. Дані подаються як середні значення ± SEM.

Відсоток варіацій, зафіксованих кожним компонентом, зазначеним на осях.

Колір клітини вказує на силу та напрямок кореляції, причому синій колір являє собою максимальну негативну кореляцію, а червоний - максимальну позитивну кореляцію.

Обговорення

Ми припустили, що дієта перед відлученням суттєво вплине на склад мікробіоти фекалій кошеняти. Це дослідження показує, що, незважаючи на велику різноманітність мікробів у фекаліях у вагітних маток, дієта перед відлученням не впливала на склад мікробіоти фекалій у нащадків, однак рівень експресії генів у крові та жировій тканині змінювався дієтою перед відлученням. Це свідчить про те, що материнський вплив на експресію генів є тривалим, тоді як його вплив на мікробні популяції може бути відносно короткочасним, незважаючи на їх відносну стабільність протягом життя особини [7], [10].

Попередні дослідження на гризунах свідчать про те, що дієта перед відлученням від грудей впливає на мікробіоти нащадків, особливо в ранньому віці [21], [32]. Поточне дослідження з використанням послідовності наступного покоління виявило, що дієта перед відлученням мала незначний вплив на склад мікробіоти в кишковому тракті кошенят, а дієти після відлучення відігравали головну роль у впливі на склад мікробіоти у фекаліях. Про це свідчать великі відмінності у розподілі тилу між вагітними матками та їх потомством. У поточному дослідженні період до відлучення включав як вагітність, так і лактацію, а також перехід потомства з молока на тверду їжу. Тому попередньо відлучене потомство зазнавало впливу молока від матері, а також дієти після відлучення. Бактеріальний видовий склад молока визначали, використовуючи як культурозалежну, так і незалежну методологію (Куксон, неопубліковані дані), і передбачав збільшення видового різноманіття молока у котів, яких годували дієтою А. Незважаючи на це, ми не бачили багатьох змін у складі мікробного складу кишечника, які були визначені до дієти перед відлученням. Навпаки, дієта після відлучення мала великий вплив на мікробіоти фекалій аналізованих кошенят.

Кошенята, яких годували дієтою Після відлучення, збільшили кількість Firmicutes та Actinobacteria та зменшили кількість фузобактерій порівняно з кошенятами, яких годували дієтою B після відлучення, згідно з результатами, що спостерігаються у дорослих котів, котрих годували подібними дієтами [9], і маток у цьому дослідженні. Більшість досліджень, що вивчають мікроби у здорових ссавців, визначили Firmicutes і Bacteroidetes як переважаючі бактеріальні популяції, що присутні в кишкових шляхах. Наше дослідження підтверджує ці результати. Однак переважна філа, виявлена в цьому дослідженні, Firmicutes і Bacteroidetes, відрізнялася від тих, що спостерігались раніше [32], які повідомляли про Firmicutes та Actinobacteria як про два найбільш поширених типи.

Актинобактерії показали зниження чисельності у кошенят, яких годували дієтою В після відлучення. До актинобактерій належать представники роду Bifidobacterium та сімейства Coriobacteriaceae. Обидва ці таксони пов’язані з покращенням здоров’я на моделях гризунів. Наприклад, вважається, що біфідобактерії покращують здоров’я кишечника [33], тоді як Coriobacteriaceae пов’язані зі зниженням обміну глюкози та холестерину в крові у гризунів [34], [35]. У поточному дослідженні кількість колінзелли було значно знижено у кошенят, яких годували дієтою В. Зниження рівня C. aerofaciens було пов’язано з низьким вмістом вуглеводів у людей [36]. Загальна частка актинобактерій у поточному дослідженні (у середньому 0,6%) була набагато нижчою, ніж раніше для кошенят (28,5%) [32] та дорослих котів (16%) [9], які годували подібними дієтами. У нашому дослідженні біфідобактерії не були виявлені, на відміну від попереднього дослідження, що вивчало мікрофлор фекалій кошенят, яких годували дієтами з високим вмістом білка (52% СД) [32]. Результати нашого поточного дослідження узгоджуються з попереднім дослідженням у нашій лабораторії з використанням дорослих котів [9], але відрізняються від попередніх досліджень [32], ймовірно, через різницю в аналітичних методологіях (дизайн праймерів тощо).

Бактероїдети пов'язані як з перетравленням білка, так і з СНО [37]. У поточному дослідженні не було відмінностей у чисельності членів Bacteroidetes, пов'язаних з дієтою; це узгоджується з результатами у дорослих котів, які харчуються подібними дієтами [9]. У середовищі Bacteroidetes чисельність бактероїдів була вищою у кошенят, яких годували дієтою В після дієтичного відлучення. У поточному дослідженні чисельність бактероїдів також була вищою у кошенят, яких годували дієтою В після відлучення. Це контрастує з результатами у дорослих котів, які продемонстрували зниження рівня бактероїдів, пов’язане з подібною дієтою [9]. Пропорції бактеріоідетів були вищими в поточному дослідженні (близько 20%) порівняно з тим, що спостерігався раніше у кошенят, яких годували помірним або високим вмістом білка: вуглеводні сухі дієти (0,2% [32]).

Кошенята, яких годували дієтою B, мали меншу кількість твердих речовин у порівнянні з кошенятами, яких годували дієтою A. Чисельність твердих комах у кошенят, яких годували дієтою A після відлучення, були подібними до тих, що повідомляли у кошенят того ж віку, які годували сухим, помірним білком: дієта CHO [32 ]. У межах типу Firmicutes спостерігались значні зрушення в ряді лактобактерій (Lactobacillus), вейлонеллацеї (Megasphaera), пептострептококки (некласифіковані Peptostreptococcaceae) та стрептококки (Streptococcus). Популяція лактобактерій була вищою у кошенят, які годувались дієтою А, порівняно з кошенятами, які годувались дієтою В. Підвищений вміст лактобактерій у раціоні А узгоджується з результатами у кошенят, які годувались сухим, помірним білком: дієти CHO [32] та дорослих котів, які годували сухими дієтами [9]. Подібно до [32], який спостерігав збільшення рівня Megasphaera, пов’язаного з помірним вмістом білка: дієта CHO, Megasphaera spp. в цьому дослідженні також було більше кошенят, яких годували дієтою А. Можливо, що збільшені пропорції Мегасфери були зумовлені збільшенням Lactobacillus spp. спостерігається в поточному дослідженні. На відміну від цього, пропорції Peptostreptococcaceae були вищими у кошенят на дієті В, що узгоджувалося з результатами у дорослих котів [9].

Фузобактерії є протеолітичними бактеріями [38] і спостерігаються у низьких рівнях здорових котів (0,3-5% послідовностей) [32], [39], [40]. Вони були пов’язані з дієтами з високим вмістом білка у кошенят [32], дорослих котів [9] та собак [41]. У поточному дослідженні чисельність філотипів, що належать до порядку Fusobacterium, була вищою у кошенят, яких годували дієтою В, порівняно з дієтою А після відлучення (15 проти 0,9% відповідно).

Загалом пропорції протеобактерій не відрізнялися між кошенятами, яких годували дієтою А або дієтою В, лише Sutterella spp. збільшено у кошенят, яких годували дієтою В після відлучення. Попередні дослідження показали збільшення протеобактерій, пов’язаних із сухим, з високим вмістом білка: вуглеводною дієтою у кошенят [32] та вологою дієтою у дорослих котів [9]. Рівні білка в поточному дослідженні були подібними (35% проти 45% у дієтах А та В відповідно) до рівня, який годували дорослим котам (32-42%) [9].

На закінчення це дослідження виявило, що, хоча дієта перед відлученням відіграє певну роль у зміні рівнів експресії генів, вона мало впливає на бактеріальні профілі фекалій нащадків. На відміну від цього, хоча формат дієти після відлучення не впливає на рівень експресії генів у нащадків, він відіграє вирішальну роль у складі бактерій у фекаліях. Чому це може бути так, представляє інтерес для майбутніх досліджень. Існують взаємозв'язки між профілями мікробіоти кишечника та генами, що беруть участь у шляху глюкози та інсуліну, і вони можуть відігравати певну роль у довгостроковому здоров'ї.

Подяки

Автори визнають допомогу пані Карін Вайдграаф та пані Маргріт Хекман (обидва Університету Мейсі) та пана Брюса Сінклера (AgResearch) під час цього дослідження.

Внески автора

Задумав та розробив експерименти: ENB NCR DGT. Виконував експерименти: ENB DGT. Проаналізовано дані: WY SK KRK. Внесені реагенти/матеріали/інструменти для аналізу: WY SK KSS. Написав папір: ENB WY SK KRK NCR KSS DGT. Отримано фінансування та розроблено та проведено дослідження на тваринах: ENB NCR DGT. Розроблено та проведено лабораторний компонент дослідження: ENB WY SK KRK.