Білок гіпоталамічного С2-домену, який бере участь у незаконному обігу MC4R та контролі енергетичного балансу

Знайдіть цього автора на Google Scholar
Знайдіть цього автора на PubMed
Шукайте цього автора на цьому сайті
Для листування: [email protected]

АНОТАЦІЯ

Об’єктивна Рівень епідемії надмірної ваги та ожиріння значно зріс за останні кілька десятиліть, і 34% дорослих та 15-20% дітей та підлітків зараз страждають ожирінням. Меланокортиновий рецептор 4 (MC4R) сприяє контролю апетиту в нейронах гіпоталамусу і є ціллю для майбутніх процедур проти ожиріння (таких як сетмеланотид) або нових зусиль з розробки лікарських засобів. Правильне регулювання незаконного обігу MC4R в нейронах гіпоталамусу має вирішальне значення для нормального нервового контролю гомеостазу і змінюється при ожирінні та наявності ліпідів. Механізми, що лежать в основі зміни торгівлі MC4R в контексті ожиріння, досі незрозумілі. Тут ми виявили, що C2CD5, експресований в гіпоталамусі, бере участь у регуляції ендоцитозу MC4R. У цьому дослідженні було викрито новий білок, який регулюється харчовими нормами в гіпоталамусі, забезпечуючи нову мішень для залежних від MC4R шляхів, задіяних у гомеостазі маси тіла та ожирінні.

Методи Для оцінки експресії C2cd5 ми вперше застосували in situ гібридизацію та технологію РНК-сканоскопії у поєднанні з електронною мікроскопією. Для in vivo ми охарактеризували енергетичний баланс мишей дикого типу (WT) та C2CD5, що нокаутували все тіло (C2CD5KO), яких годували нормальним чау (NC) та/або західною дієтою (з високим вмістом жиру/високим вмістом сахарози/холестерину) (WD ). З цією метою ми провели комплексну поздовжню оцінку ваги тіла, енергетичного балансу (споживання їжі, витрат енергії, рухової активності за допомогою метаболічних клітин ТСЕ) та гомеостазу глюкози. Крім того, ми оцінили наслідок втрати C2CD5 на зміни поведінки годування, які зазвичай спричинені ін'єкцією агоніста MC4R (Melanotan, MTII) у паравентрикулярний гіпоталамус (PVH). Для підходу in vitro ми розібрали роль C2CD5 та його кальцій-чутливого домену C2 у торгівлі MC4R. Ми зосередилися на ендоцитозі MC4R за допомогою експерименту з вигодовуванням антитіл (у клітинній лінії нейронів - Neuro2A (N2A), стабільно експресуючий HA-MC4R-GFP; проти HA-мітки та проаналізований за допомогою флюсової цитометрії).

Результати Ми виявили, що 1) експресія гіпоталамусного C2CD5 знижується на моделях ожиріння, спричинених дієтою, порівняно з контролем, 2) миші, у яких відсутній C2CD5, демонструють збільшення споживання їжі порівняно з мишами WT, 3) C2CD5 взаємодіє з механізмами ендоцитозу в гіпоталамусі, 4) втрата функціонального C2CD5 (не має домену C2) притуплює ендоцитоз MC4R in vitro і збільшує MC4R на поверхні, яка не реагує на ліганд MC4R, і, 5) миші C2CD5KO демонструють знижену гостру реакцію на введення MTII у PVH.

Висновки Виходячи з них, ми робимо висновок, що гіпоталамус C2CD5 бере участь у ендоцитозі MC4R та регулює гомеостаз ваги тіла. Ці дослідження дозволяють припустити, що C2CD5 являє собою новий білок, що регулюється метаболічними ознаками та бере участь у ендоцитозі метаболічних рецепторів. C2CD5 представляють нову ціль і шлях, на який можна націлити при ожирінні.

1. Вступ

Одним із перших генів меланокортинової системи, що вивчали за допомогою генетичної делеції у мишей, був MC4R, рецептор, зв’язаний з G-білком. Порушення MC4R у мишей призвело до фенотипу ожиріння, що підкреслює потенційну роль MC4R у ожирінні [15,16]. Мутації MC4R є відносно поширеною причиною важкого ожиріння [17,18,19,20]. Люди з мутаціями MC4R призвели або до посилення [21], або до втрати функції [17,18]. Вважається, що багато з цих мутацій спричиняють або утримання мутованих рецепторів всередині клітини, що призводить до втрати агоністичної відповіді [22,23], або зміну інтерналізації або переробки [21,24].

Агоністи MC4R знижують споживання їжі та BW [25]. Варто відзначити, що нещодавні випробування фази 3 сетмеланотиду, агоніста MC4R, у пацієнтів із ожирінням досягли своїх основних кінцевих точок, які поставили його для виведення препарату на ринок у 2020 році. Серед учасників, які досягли порогу втрати ваги через 12 тижнів, середнє зниження рівня тіла вага протягом дослідження становила 25,4%. Повідомляється про зниження голоду на 27,8% серед цих учасників. Багато сучасних клінічних випробувань спрямовані на зменшення споживання їжі та спрямовані на передачу сигналів та торгівлю MC4R. Дуже важливо зрозуміти нейробіологію, що лежить в основі дії наркотиків, і краще визначити активацію MC4R та циклічність. У цьому дослідженні ми ідентифікуємо новий білок незаконного обігу MC4R, який може бути націлений на ожиріння.

Деякий час відомо, що гіперкалорійні дієти, що містять насичені жирні кислоти, індукують резистентність до інсуліну та лептину, втрату достатку ліганду MC4R α-MSH), стрес ендоплазматичного ретикулума та запалення [24]. Попередні дослідження показали, що під час ліпідного стресу погіршується інтерналізація MC4R в ендосоми, а також перенаправлення рецепторів до лізосом, що призводить до зміни десенсибілізації [24]. Специфічні білки, такі як MRAP, які беруть участь у переміщенні MC4R до плазматичної мембрани, були широко вивчені [26,27]. Нещодавно було показано, що мутація людини, яка може вплинути на ендоцитоз або переробку MC4R [21], впливає на гомеостаз ваги тіла, однак конкретні білки, що беруть участь у процесі ендоцитозу/переробки MC4R, ще не визначені.

Тут ми ідентифікуємо кальцій- і ліпід-зв’язуючий білок домену C2, C2CD5 [28], які сприяють регуляції ендоцитозу MC4R. C2CD5 сильно експресується в гіпоталамусі, і його рівень знижується при ожирінні та у присутності насичених жирних кислот. Наші дані вказують на те, що гіпоталамус C2CD5 - це новий білок, що продає рецептори, який реагує на метаболічні сигнали та бере участь у нейронному контролі енергетичного балансу.

2. Матеріали та методи

2.1. Догляд та використання тварин

Усі дослідження проводились відповідно до рекомендацій Керівництва з догляду та використання лабораторних тварин Національного інституту охорони здоров’я та схвалення Інституційного комітету з догляду та використання тварин Університету Лойоли. C57BL/6J (# 000664) були отримані з лабораторії Джексона (штат Мен, США), а C2CD5KO - від Техаського інституту генетичної медицини A&M (Коледж-Стейшн, Техас). Мишей з однаковим генетичним походженням порівнювали у всіх дослідженнях. Мишей генотипували, а нокаут білка оцінювали за допомогою імуноблотів (Додатково 2). Всіх мишей розміщували по 4 особи в клітці під час циклу 12:12 год світло/темно. Миші отримували або NC (Teklad LM-485), або WD (TD88137, Teklad Diets; 42% ккал від жиру, 34% ваги сахарози та 0,2% загального холестерину) (Envigo, штат Індіана, США) протягом 12 тижнів після первинної оцінки енергетичний баланс та гомеостаз глюкози до дивергенції ЧБ (

тиждень 7-8 віку). BW реєстрували щотижня після відлучення. Усі згадані метаболічні дослідження проводились з використанням як однолітків, так і самців мишей, з експериментатором, засліпленим як для лікування, так і для генотипу, використовуючи рекомендації ARRIVE.

2.2. Культура клітин

Клітини N2A, стабільно трансфіковані HA-MC4R-GFP (люб'язно надані д-ром Джулією Бальдіні), культивували в DMEM з L-глутаміном та піруватом натрію з додаванням 10% FBS та пеніциліном/стрептоміцином. Клітини N2A, які стабільно експресують HA-MC4R-GFP, були описані раніше [29].

2.3. Тести на толерантність до глюкози та інсуліну

Тестування на толерантність до глюкози та інсуліну проводили, як описано раніше [30,31,32]. Для толерантності до глюкози мишам, що постили на ніч (12 годин), вводили внутрішньовенно дозу глюкози (1 г/кг мас. Т. Д.) Після вимірювання рівня глюкози натще. Потім рівень глюкози в крові контролювали через 15, 30, 60, 120 хв після ін’єкції, використовуючи глюкометр AlphaTrak для гризунів (Fisher Scientific, Пенсільванія, США). Для толерантності до інсуліну мишам голодували протягом 4 годин і вводили внутрішньовенно дозу інсуліну (0,5 од/кг т. Д., Human-R Insulin U100, Lilly) з контролем рівня глюкози до і після, як описано вище.

2.4. Вестерн-блот

Виділення гіпоталамуса або цілоклітинного білка та вестерн-блотинг проводили, як описано раніше [30]. Коротко кажучи, цілі клітини або гіпоталамус виділяли, гомогенізували в крижаному буфері для лізису (1XPBS + 1% Triton X-100 + 0,01% SDS + інгібітор протеази/фосфатази). Рівний білок завантажували та розчиняли за допомогою 4–15% збірних білкових гелів Mini-PROTEAN (Bio-Rad, # 4561086) і переносили на мембрани PVDF (Bio-Rad), і обробляли на актин (abcam, # ab8226), HA ( Biolegend, # 901513), та, C2CD5 (# A301-469A, Bethyl laboratories, Montgomery, TX) у розведеннях, рекомендованих постачальником. Імуноблоти аналізували за допомогою ImageJ та нормалізували до рівня актину і складали графіки з використанням контрольних груп як 100%.

2.5. Аналіз метаболічної клітини

Вимірювання метаболізму проводили за допомогою TSE Phenomaster (системи TSE, Честерфілд, Міссурі) на мишах WT та C2CD5KO до розбіжності BW, щоб уникнути змішуючих ефектів BW на енергетичний баланс [33] та, як описано раніше [31]. Параметри енергетичного балансу також оцінювали в метаболічних клітинах, використовуючи парадигму випаровування до пари перед відведенням БТ.

2.6. Імунопреципітація

Для ідентифікації білків, які взаємодіють із C2CD5, використовували гіпоталамус від 10-тижневих самців мишей WT. Гіпоталамі гомогенізували і визначали рівні білка (набір для аналізу білка BCA, Thermo Fisher, №23235). П’ять сотень мікрограмів білка інкубували з 1 мкг кролячого поліклонального антитіла проти C2CD5 (лабораторії Bethyl, № A301-469A) і обертали протягом ночі при 4 ° C. Протягом ночі зразки інкубували з 25 мкл білкових магнітних гранул A/G (Thermo Fisher, №88803), обертаючись протягом 4 годин при 4 ° C. Білки елюювали з гранул 50 мкл лізисного буфера, що містить β-меркаптоетанол, і аналізували за допомогою мас-спектрометрії, як описано нижче.

Для вивчення комплексу, що містить C2CD5, AP2 та HA-MC4R-GFP у клітинах N2A, використовували експериментальні умови co-IP з використанням анти-C2CD5 або анти-HA (1: 150, Biolegend, # 901513), як описано вище.

2.7. Протеоміка та аналіз РС

Для IP C2CD5 гелеві смуги/смужки вирізали, очистили, знебарвили та піддали тригептичному перетравленню в гелі. Отримані пептиди пропускали через LC-MS/MS. Файли необроблених даних були оброблені та кількісно оцінені за допомогою пошуку, проведеного в базі даних UniProt, за допомогою програмного забезпечення PEAKS з оцінкою білкової достовірності -10 lgP більше 20, що вважається високою достовірністю.

2.8. Конструкції ДНК

Клон кДНК у повний зріст людини KIAA0528 (приєднання № BC117143) був отриманий від Dharmacon Research, Inc з IMAGE клоном ID 40125694. Клон надавали у векторі pCR4-TOPO. Мутанти C2CD5-mCherry та ΔC2 були зроблені методом ПЦР-спрямованого мутагенезу, описаного нижче, а послідовності ДНК для всіх конструкцій експресії підтверджені перед використанням у дослідженнях експресії та підтверджені для експресії білка за допомогою імуноблотингу. Для отримання вектора експресії C2CD5-ΔC2 перші 405 нуклеотидів видаляли з 5 'кінця кДНК C2CD5 за допомогою рестрикційних ферментів Mlu1 (сайт MCS) і Cla1 (405), а полілінкер використовували для лігування решти кДНК у правому полум'ї до pCMV5 вектор. Для експресії повнорозмірного C2CD5, злитого з mCherry на його С-кінці, стоп-кодон перед сайтом BamH1 видаляли за допомогою ПЛР-мутагенезу, а кДНК лігували у вектор pcDNA3-mCherry у сайтах Mlu1 та BamHI.

2.9. Стереотаксична хірургія

Стереотаксичні операції проводили для хронічного імплантації направляючих канюль (Plastics One Inc., Роанок, штат Вірджинія, США), спрямованих на PVH. Мишей знеболювали за допомогою ізофлурану і встановлювали на стереотаксичний апарат з атравматичними вушними раковинами (Stoelting Co., Wood Dale, штат Іллінойс). Для PVH використовувались наступні координати, отримані від Paxinos, George & Franklin, Keith BJ (Мозок миші в стереотаксичних координатах, 2001): передня-задня, -0,55 мм; медіально-латеральний, -0,2 мм; спинно-черевна, -4,6 мм, та ін’єкційна голка з проекцією 0 мм.

2.10. Лікування меланотаном II (MTII)

Після відновлення після стереотаксичної хірургічної операції вимірювали метаболічні параметри у мишей WT та C2CD5KO. Мишам мікроін'єктували або носій, або aCSF (Гарвардський апарат, № 59-7316), або агоніст MCR, MTII (30 ммоль/л) (Phoenix Pharmaceuticals, штат Вірджинія, США, № 043-29) протягом 30 секунд; голку залишали на місці додаткові 10–15 сек, щоб мінімізувати потенційний потік вгору по каналу канюлі. Також оцінювали вплив агоніста MCR на споживання їжі. Для цього мишей позбавляли їжі на ніч (

16 годин) перед мікроін’єкцією MTII або aCSF, щоб виявити зменшення споживання їжі. Після мікроін’єкцій мишей поміщали назад у метаболічні клітини. Споживання їжі визначали через 2, 4, 6, 12, 24 та 48 годин після ін’єкції, як описано вище. Також проводились вимірювання ЧВ. Дослідження повторили через 4-денний період, таким чином, що кожним мишам вводили aCSF та MTII (порядок врівноважений), щоб забезпечити достатній час вимивання, щоб запобігти залишковим ефектам лікарського засобу. Будь-яка можлива мінливість ефективності годівлі через незначні відмінності в ЧБ в межах групи враховується в результаті проекту повторних вимірювань та вимірювання ефектів aCSF та MTII у тих же мишей.

2.11. Гібридизація in situ

Флуоресценцію in situ гібридизацію (FISH) проводили на зрізах товщиною 20 мкм мозку мозку мишей із використанням флуоресцентних мультиплексних реагентів RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, 320850) відповідно до інструкцій виробника. РНК-зонди для C2cd5 та Mc4r (Advanced Cell Diagnostics, 436771 та 319181-C3 відповідно) інкубували з мозковими зрізами, а посилення сигналу було досягнуто за допомогою мультиплексних реагентів відповідно до інструкцій. Зображення були зроблені за допомогою інвертованого мікроскопа Olympus IX80, оснащеного флуоресцентним джерелом світла X-Cite 120Q (Lumen Dynamics) та CD-камерою CoolSNAP HQ2 (Photometrics). Обробка зображень та кількісна оцінка сигналів РНК проводилася за допомогою програмного забезпечення CellSens (Olympus Corporation, Waltham, Massachusetts).

2.12. Визначення HA-MC4R-GFP на поверхні клітини за допомогою проточної цитометрії

Загальний MC4R, присутній на поверхні клітини, визначали за допомогою проточної цитометрії за допомогою LSRFortessa (BD Biosciences, Сан-Хосе, Каліфорнія). Коротко кажучи, клітини N2A (HA-MC4R-GFP) трансфікували або C2CD5-mCherry, або ΔC2-C2CD5-mCherry, використовуючи реагент для трансфекції Continuum (Gemini Bio, № 400-700). Трансфіковані клітини обробляли BSA без FFA або пальмітатом (200 мкМ) протягом 18 годин. Живі клітини промивали повним середовищем та інкубували з анти-HA антитілом (1: 500, Biolegend, # 901513) протягом 2 годин при 4 ° C до фіксації. HA-MC4R-GFP, присутній на клітинній поверхні, оцінювали за допомогою кон'югованого антитіла Alexa 647 у непроникних умовах. Загальну кількість клітин HA-MC4R-GFP визначали кількісно, вимірюючи інтенсивність флуоресценції GFP. Для визначення частки загального рецептора, що проживає на клітинній поверхні, для кожного стану визначали співвідношення HA-MC4R-GFP на клітинній поверхні (флуоресценція Alexa 647)/загальний рецептор (флуоресценція GFP).

Для вивчення впливу α-MSH на кількість MC4R на поверхні клітини клітини N2A з вищезазначених груп інкубували протягом 1 години при 37 ° C з DMEM, що містить 100 мкМ циклогексиміду, для інгібування синтезу білка. Потім клітини інкубували у безперервній присутності циклогексиміду з або без 100 нМ α-MSH протягом 30, 60 та 120 хв. Клітини фіксували, і клітинну поверхню MC4R вимірювали, як описано вище.

2.13. аналіз табору

Клітини N2A з вищезазначених умов обробляли DMEM, що містить 0,5 мМ IBMX протягом 10 хв при 37 ° C, а потім стимулювали 0,5 мМ IBMX та 200 нМ MTII протягом 15 хв при 37 ° C. Зразки збирали в 0,1 М HCl, що містить 0,5 мМ IBMX, центрифугували та аналізували відповідно до інструкцій виробника (Enzo Life Sciences). Зібрані супернатанти в 0,1М HCl також використовували для визначення концентрації білка за допомогою аналізу білка BCA.

2.14. ІмуноЕМ

Процедури підготовки мозкової тканини до електронної мікроскопії були змінені з Figge et al., 2013 та Yi et al., 2001 [34,35]. Коротко, WT-мишей глибоко знеболювали ізофлураном і транкардіально перфузували 10 мл PBS, потім 100 мл PB, що містить 2% параформальдегіду (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), 2,5% глутаральдегіду (Electron Microscopy Sciences) і 0,01% кальцію були отримані хлоридні та коронарні зрізи через ростро-каудальний простір гіпоталамуса. Зображення отримували за допомогою просвічувального електронного мікроскопа CM120 із (TSS Microscopy, Beaverton, OR), оснащеного 16-мегапіксельною цифровою камерою BioSprint (Advanced Microscopy Techniques, Woburn, MA).

2.15. TIRF мікроскопія

Для візуалізації клітин був використаний масляний заглибний об'єктив Apo TIRF 60 × 1,49 з глибиною проникнення близько 100 нм. Клітини N2A трансфікували або плазмідою, що містить лише mCherry, або ΔC2-C2CD5-mCherry, як описано вище, у посуді із 35-міліметровим скляним дном (MatTak Corp, Ashland, Massachusetts). Були ідентифіковані позитивно трансфіковані клітини N2A, і передача MC4R до зони TIRF (GFP puncta) реєструвалась кожні 5 хв протягом 30 хв за допомогою мікроскопа та інкубаційної системи Nikon Eclipse-Ti TIRF, підтримуваної при 37 ° C.

2.16. Кількісна оцінка та статистичний аналіз

Усі дані представлені як середнє значення ± S.E.M. Аналіз проводився з використанням IBM SPSS Statistics 24. Для порівняння однієї групи застосовували 1-або 2-хвостий t-тест, як слід, і проводили багаторазові порівняння за допомогою ANOVA. Для повторних вимірювань використовували двосторонній ANOVA і значення р менше 0,05 вважали значущим.

3. Результати та обговорення

3.1. Експресія C2CD5 в мозку

Раніше було показано, що C2CD5 бере участь у торгівлі GLUT4 адипоцитами [28], а також у чутливості до інсуліну та побурінню жирової тканини [36]. Поки що про експресію та функцію C2CD5 у мозку не повідомляється. У цьому дослідженні ми вперше показуємо присутність мРНК C2cd5 у мозку за допомогою гібридизації in situ (рис. 1А). Результати in situ демонструють виражену експресію у всьому мозку з високою присутністю в гіпоталамусі (рис. 1A1). Ми спостерігали, що рівень мРНК та білків C2CD5 знижується в гіпоталамусі західної дієтичної моделі ожиріння та органотипічних культурах гіпоталамусу ex vivo, оброблених насиченими жирними кислотами, (рис. 1B-E). Ці дані свідчать про роль C2CD5 у центрах гіпоталамусу. Ми провели імуно-електронну мікроскопію з високою роздільною здатністю для візуалізації клітинної локалізації C2CD5 у гіпоталамусі. Імуноголдове маркування тканини гіпоталамусу показало наявність C2CD5 поблизу плазматичної мембрани та мітохондріальної мембрани (рис. 1F).