ADAM17 є промотором пухлини та терапевтичною мішенню при раку товстої кишки, пов’язаному із західною дієтою

Анотація

Призначення: Рецептори епідермального фактора росту (EGFR) необхідні для просування пухлини західною дієтою. Металопротеаза ADAM17 активує EGFR, виділяючи про-EGFR ліганди. ADAM17 регулюється G-білковими рецепторами, включаючи CXCR4. Тут ми досліджували перехресні зв’язки CXCR4 – ADAM17 та вивчали роль ADAM17 у пухлинному генезі.

Експериментальний дизайн: Ми використовували інгібітор CXCR4, інгібітор AMD3100 та ADAM17, BMS566394, щоб оцінити перехресні зв’язки CXCR4 – ADAM17 у клітинах раку товстої кишки. Ми порівняли експресію ліганду CXCR4, CXCL2 та ADAM17 у мишей, яких годували західною дієтою, проти стандартної дієти. Окремо мишей обробляли маримататом, інгібітором ADAM17 широкого спектру або AMD3100 для оцінки активації EGFR ADAM17 та CXCR4. За допомогою мишей Apc-мутантів Min ми досліджували вплив інгібітора ADAM17/10 INCB3619 на пухлину. Для оцінки ефекту колоноцитів ADAM17 мишей з умовною делецією ADAM17 обробляли азоксиметаном (AOM). Експресію ADAM17 також порівнювали в колоноцитах первинного раку товстої кишки людини та сусідньої слизової.

Результати: Лікування CXCL12 активувало сигнали EGFR клітин раку товстої кишки, а блокада CXCR4 або ADAM17 зменшувала цю активацію. In vivo західна дієта підвищувала CXCL12 у стромальних клітинах та TGFα у колоноцитах. Марімастат або AMD3100 спричиняли> 50% зниження сигналів EGFR (Р у 2,5 рази у злоякісних колоноцитах людини.

Трансляційна актуальність

Західні дієти причетні до епізодичного раку товстої кишки. Рецептори епідермального фактора росту (EGFR) підвищені при раку товстої кишки людини і необхідні для просування пухлини західною дієтою на моделях раку товстої кишки. EGFR активується рецепторними лігандами, що вивільняються з мембранно пов'язаних пролігандів. ADAM17 і ADAM10 є основними ферментами, які регулюють вивільнення ліганду EGFR. Хоча ADAM17 збільшується при спорадичному раку товстої кишки, жодні дослідження безпосередньо не перевірили, чи сприяє цей фермент розвитку пухлини. Більше того, оскільки ADAM17 контролює вивільнення багатьох субстратів, його роль у розвитку раку товстої кишки непередбачувана. У цьому дослідженні, використовуючи як генетичні, так і хімічні моделі раку товстої кишки, ми вперше демонструємо, що ADAM17 і, можливо, ADAM10 сприяють розвитку пухлини. Це встановлює ADAM17 як потенційну терапевтичну мішень у профілактиці раку товстої кишки. Крім того, ми виявили потенційно важливий шлях, що пов'язує ADAM17 із західним раціоном товстої кишки, що пропагує дієту, із залученням CXCL12-CXCR4 як сигналів, що активують ADAM17.

Вступ

Рак товстої кишки є основною причиною захворюваності та смертності, пов'язаних з раком, у західному світі (1). Більшість раків товстої кишки є спорадичними, і західні дієти беруть участь у їх патогенезі (2). Західні дієти містять мало засвоюваних клітковини і багаті тваринними жирами. Зростаючі епідемії ожиріння та цукрового діабету в Сполучених Штатах пов’язані із західною дієтою, а також з підвищеним ризиком раку товстої кишки (3, 4). Що викликає занепокоєння, поширеність раку товстої кишки у всьому світі зростає, оскільки все більше країн приймають західні дієти (1, 5). Таким чином, зусилля з метою глибшого розуміння механізмів, за допомогою яких західні дієти сприяють раку товстої кишки, важливі для розробки більш ефективних стратегій запобігання цій хворобі.

Експериментальні моделі раку товстої кишки широко застосовуються для розкриття впливів, пов’язаних з дієтою, при пухлині товстої кишки. Як генетична Apc-мутантна миша Min, так і індукована канцерогеном азоксиметан (AOM) модель раку товстої кишки широко використовуються для дослідження ролі дієтичних факторів у розвитку пухлини (6, 7). Західна дієта сприяє пухлинному розвитку в моделі мишей AOM та Min (8–10). У попередніх дослідженнях із використанням інгібіторів EGFR ми показали, що сигнали від цих рецепторів потрібні для ефективного розвитку AOM-індукованого пухлини у гризунів (11, 12). Ми також встановили, що цей рецептор необхідний для промоції пухлини, спричиненої західною дієтою, на моделях AOM та азоксиметан/декстран сульфат натрію (AOM/DSS) (9, 10).

EGFR є членом сімейства трансмембранних рецепторів тирозинкінази ErbB, що контролює ріст і диференціювання епітелію товстої кишки (13). EGFR експресується на епітеліальних клітинах товстої кишки та клітинах строми, включаючи фібробласти та ендотеліальні клітини (14, 15). Цей рецептор активується численними лігандами, включаючи TGFα та амфірегулін (AREG), які виробляються в товстій кишці епітеліальними клітинами та стромальними клітинами. Після зв’язування лігандів EGFR гомодимеризується або гетеродимеризується з іншими членами ErbB. Димеризація стимулює внутрішню активність рецептора тирозинкінази (13). При раку товстої кишки EGFR найчастіше активізується збільшенням кількості лігандів (16). У зв’язку з цим ми показали, що лише західна дієта підвищує TGF слизової оболонки товстої кишки, тоді як TGFα та амфірегулін підвищуються в пухлинах товстої кишки (9).

Ферменти ADAM (члени сімейства дезинтегрину та металопротеїнази) регулюють розщеплення лігандів EGFR від зв’язаних з мембраною пролігандів. Вивільнення TGFα та AREG контролюється ADAM17, який, як було показано, підвищений у раку товстої кишки людини (17). Оскільки західна дієта підвищувала TGFα, цікавим було вивчити вплив західної дієти на експресію ADAM17. У багатьох видах раку ADAM17 також є точкою зближення нижче за G-білковими рецепторами (GPCR; посилання 18), що може збільшити активність ADAM17. У зв'язку з цим GPCR CXCR4 та його ліганд CXCL12 причетні до прогресування раку товстої кишки (19). Використовуючи фармакологічні інгібітори, ми запитали, чи може західна дієта змінити CXCL12 in vivo та чи можуть сигнали CXCL12 – CXCR4 регулювати сигнали ADAM17 – EGFR у клітинах раку товстої кишки in vitro. Марімастат - це інгібітор металопротеази широкого спектра, який блокує активність ADAM17, а AMD3100 - потужний інгібітор CXCR4 (20, 21). Тут, використовуючи маримастат та AMD3100, ми дослідили вимоги до активності ADAM17 та сигналів CXCL12 – CXCR4 у західних дієтах, що стимулюються до сигналів EGFR товстої кишки.

У фібробластах ADAM17 та ADAM10 регулюють вивільнення різних лігандів EGFR (22). Наявність подвійного інгібітора ADAM17 та ADAM10 INCB3619 дозволило нам вивчити роль цих ферментів у кишковому пухлинному розвитку у миші Min (23). Ця модель вимагає сигналів EGFR для надійного туморогенезу і відповідає західній дієті підвищеним навантаженням на пухлини (8, 24, 25). Для виділення ефектів ADAM17 та аналізу клітин-специфічної ролі ADAM17 у розвитку раку товстої кишки, ми вивчили ефект видалення ADAM17 з епітеліальних клітин товстої кишки в моделі AOM. Таким чином, у поточному дослідженні ми розглянули роль ADAM17 у двох різних моделях раку товстої кишки, що просуваються західною дієтою. Використовуючи специфічний для ADAM17 інгібітор BMS566394, ми також визначили, що сигнали CXCL12 – CXCR4 активують EGFR через ADAM17 у клітинах раку товстої кишки. У сукупності результати цього дослідження розширюють наше розуміння ланцюга CXCL12 – CXCR4, що активує ADAM17 як потенційний зв’язок між EGFR та західною дієтою при раку товстої кишки.

Матеріали та методи

Детальніше див. Додаткові матеріали та методи.

Дослідні тварини

Архівна тканина слизової оболонки товстої кишки для хронічних досліджень дієти.

Усі дослідження на тваринах були схвалені Комітетом з догляду та використання тварин при Чиказькому університеті і повністю відповідають керівним принципам NIH щодо гуманного використання тварин. Архівні зразки були доступні в попередніх дослідженнях, взятих у контрольних мишей, яких годували стандартною дієтою (5% жиру) або західною дієтою (20% жиру) протягом 40 тижнів (9). Зразки включали дистальні сегменти товстої кишки, зафіксовані в 10% формаліні або заморожені в середовищі оптимальної температури різання (OCT), а також РНК та білки зі скребкової ізоляції слизової оболонки товстої кишки

Гострі західні дієтичні дослідження

Експерименти Marimastat та AMD3100.

Ми використовували мишей A/J для гострих дієтичних досліджень, оскільки планували вивчити розвиток пухлини товстої кишки в моделі AOM, яка вимагала миші, сприйнятливої до AOM. Самцям мишей A/J імплантували насоси Alzet, які доставляли 1,1 мкмоль маримастату на день на мишу в 50% поліетиленгліколі (PEG) або 50% PEG (контроль транспортного засобу), або 0,126 мкмоль AMD3100 на мишу на день або воду (контроль транспортного засобу) . У кожній групі було 10 мишей. Марімастат - інгібітор металопротеази широкого спектру дії, а AMD3100 - інгібітор CXCR4 (21, 26). Мишам давали 48 годин на відновлення після імплантації насоса, а потім годували західною дієтою (9). Мишей забивали через 2 тижні, залишали слизову оболонку товстої кишки зіскрібкою та швидко заморожували. Кругові сегменти (довжиною 3 мм) заморожували в ОСТ або фіксували у 10% забуференному формаліні та вкладали у парафін для імунозабарвлення. Для досліджень AMD3100 мишам вводили бромодезоксиуридин (BrdUrd) 1 мл/100 г ваги тіла за 2 години до жертви, як рекомендує виробник.

Apc-мутант Дослідження на мишах Min.

Мишей Apc-мутантів Min на фоні C57Bl6/J, що містять усічую мутацію в Apc кодоні 850, було отримано з лабораторії Джексона (# 002020). Мишей генотипували за рекомендацією лабораторії Джексона. У віці 6 тижнів мишей Min (самців і самок) рандомізували і годували західною дієтою (n = 20) або західною дієтою, доповненою INCB3619 (n = 20; 860 мг/кг чау). INCB3619 додавали у вигляді порошку, змішаного з сахарозою, і забезпечували 120 мг/кг маси тіла/день. Склад західної дієти був описаний раніше (9). Мишей забивали у віці 7 місяців, а пухлини розміром> 2 мм збирали на 4-сантиметрові сегменти з дванадцятипалої кишки, тонкої кишки та клубової кишки та всієї товстої кишки, як описано раніше (27). Пухлини збирали для білків і РНК, а сегменти фіксували у формаліні для імунофарбування. Контрольні білки та РНК готували за допомогою вишкрібання з безпухлинної слизової оболонки товстої кишки.

Дослідження ADAM17 LoxP

Гострі дослідження adeno-Cre ADAM17 LoxP.

Мишей з послідовностями LoxP, що фланкують екзон 2 ADAM17, отримували з лабораторії Джексона (номер запасу 009597) та генотипували, як рекомендовано. Для підтвердження умовної делеції ADAM17 ми обробляли гомозиготних мишей ADAM17LoxP внутрішньоректальним адено-Cre або adeno EV (контроль), як описано раніше (28). Через 7 днів мишей забивали, а дистальні сегменти товстої кишки заморожували в OCT і фарбували на ADAM17.

Хронічні дослідження пухлини villin-Cre ADAM17 LoxP AOM.

Гомозиготні миші ADAM17LoxP, спочатку на тлі C57Bl6, були виведені 10 поколінь на чутливий до AOM фон A/J і спаровані з мишами, що експресують віллін-Кре, які також були схрещені 10 поколінь з фоном A/J. Експериментальні миші та гомозиготні віллін-Cre + -гомозиготні ADAM17 LoxP (ADAM17Δ/Δ) та контролери однорідних мишей гомозиготних мишей ADAM17 LoxP, у яких відсутній трансген-віллін-Cre, отримували AOM 10 мг/кг маси тіла щотижня протягом 6 тижнів. Потім мишей годували західною дієтою (9). Розвиток пухлини контролювали за допомогою колоноскопії, і мишей жертвували через 24 тижні після першої ін’єкції АОМ (29). Товста кишка була вирізана, а пухлини класифіковані гістологічно патологою ШКТ (Дж. Харт). Індуковані AOM пухлини та контрольна слизова оболонки лівої товстої кишки мишей ADAM17LoxP, сумісних з генотипом, оброблених фізіологічним розчином (AOM-носій), фіксували в 10% формаліні або на заморожуванні, заморожували в OCT або заморожували для екстракції РНК та білка.

Виділення колоноцитів і стромальних клітин зі слизової оболонки товстої кишки

Ми виділили колоноцити та стромальні клітини згідно з раніше опублікованими методами з незначними модифікаціями (30, 31). Коротко кажучи, товсту кишку видаляли, а слизову ізолювали та подрібнювали лезом бритви на шматки по 2 мм. Фрагменти збирали в пробірки, що містять 6 мл стерильного холодного льоду транспортного середовища, 50 МО/мл пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину та 0,5 мг/мл гентаміцину. Тканину промивали три рази обережною інверсією, збирали за допомогою гравітаційного осадження і ресуспендували в 10-мл хелатному буфері (транспортне середовище плюс 1 ммоль/л ЕДТА і 1 ммоль/л ЕГТА). Тканину інкубували на шейкері протягом ночі при 4 ° C, щоб виділити колоноцити в супернатант. Гранулу тричі промивали 3 мл крижаного PBS, виділяючи залишкові колоноцити, і супернатанти, що містять колоноцити, об'єднували. Фракції епітеліальних клітин (супернатанти) і фракції стромальних клітин (гранули) центрифугували при 400 × g протягом 5 хвилин при 4 ° C, отримуючи нещільно упаковані гранули, з яких білки розчиняли в 2 × буфері Леммлі.

Культура клітин та розповсюдження

Клітини раку товстої кишки людини HCT116 та HT29 були отримані протягом 6 місяців від ATCC та аутентифіковані ATCC за допомогою коротких тандемних повторних відбитків ДНК. Клітини культивували при температурі 37 ° С у зволоженій атмосфері 5% СО2–95% повітря в умовах, рекомендованих ATCC. Для експериментів з трансактивації EGFR попередньо злиті клітини попередньо обробляли протягом 2 годин 20 мкг/мл антитіл C225, 5 мкмоль/л BMS566394, 10 нг/мл AMD3100 або PBS (носій), а потім 50 нг/мл CXCL12 або носій. Позитивний контроль включав клітини, оброблені 10 нг/мл EGF. У зазначений час клітини розбивались, а лізати досліджували білки за допомогою Вестерн-блот.

ПЛР у режимі реального часу

РНК екстрагували із швидкозамороженої тканини за допомогою міні-набору RNeasy Lipid Tissue Mini. Зразки гомогенізували в кульовому змішувачі і завантажували на РНК-зв'язуючу спінову колонку, промивали і розщеплювали ДНКазою I і елюювали в 30-мкл буфері для елюції. Зразки досліджували на чіпі Agilent на чистоту РНК та кількісно визначали за допомогою Ribogreen. РНК (100 нг) була зворотно транскрибована в кДНК за допомогою набору зворотної транскрипції великої ємності в загальному обсязі 20 мкл. Умови інкубації становили 25 ° C протягом 10 хвилин, 37 ° C протягом 120 хвилин і 85 ° C протягом 5 хвилин. Отриману першоцепочечну комплементарну ДНК (кДНК) використовували як шаблон для кількісної ПЛР у трьох примірниках, використовуючи Fast SYBR Green Master Mix Kit. Детальніше див. У Додаткових методах.

Фарбування in situ для транскриптів TGFα

Круглі сегменти товстої кишки (12 мкм), заморожені в OCT, готували кріостатом, поміщали на предметні стекла Superfrost Plus, фіксували в 4% параформальдегіді в PBS протягом 20 хвилин і двічі промивали DEPC-PBS протягом 5 хвилин. Гібридизацію in situ та виявлення транскриптів TGFα проводили з використанням антисмислових олігонуклеотидних зондів Exiqon miCURY LNA, мічених 5′- та 3′-, з дигоксигеніном (див. Додаткові методи для отримання додаткової інформації).

Вестерн-блот

Білки екстрагували в SDS-вмісному буфері Леммлі, кількісно визначали за допомогою аналізу білка RC-DC і піддавали вестерн-блоттингу, як описано раніше (9). Рівні експресії білка виражали у кратному розмірі зазначеного білка в виділеній зіскрібком без пухлини слизовій оболонці кишечника (Apc +/Min миші) або слизовій оболонці товстої кишки від мишей ADAM17LoxP, які відповідали сольовому розчину, сольовим сольовим розчином Окремі аликвоти досліджували на β-актин.

Статистичний аналіз

Дані денситометрії вестерн-блоттінгу нормалізували як складку оброблених носієм (клітини) або нормальної слизової оболонки (мишей) і виражали як середні значення ± SD. Відмінності між кількома групами оцінювали за допомогою ANOVA, а відмінності між конкретними групами потім порівнювали за допомогою неспареного t-критерію Стьюдента. Реакції зворотної транскриптази проводили у двох примірниках та аналізували у трьох примірниках, а значення Ct усереднювали. Нетрансформовані значення Ct порівнювали між групами (33). Відносну чисельність, виражену як 2 ΔΔCt, обчислювали шляхом піднесення оцінених різниць у Ct та значущості між групами, розрахованих за допомогою критерію t Стьюдента. Частота пухлин визначалася як відсоток мишей, принаймні з однією пухлиною, і порівнювалася за допомогою точного тесту Фішера. Кратність пухлини визначали як середню кількість пухлин на одну мишку, що несе пухлину, та порівнювали за допомогою U-тесту Манна – Уітні. Для всіх статистичних аналізів значення P ≤ 0,05 вважали статистично значущими.

Результати

Західна дієта підвищує рівень сигнальних компонентів CXCL12 та EGFR

Раніше ми досліджували вплив західної дієти на розвиток раку товстої кишки (9). Для поточного дослідження ми використовували заархівовані зразки з контрольної групи попереднього дослідження для аналізу впливу дієти лише на сигнали EGFR. Ми досліджували рівні транскрипту та експресії білка ADAM17, pro-TGFα та K-Ras у слизовій оболонці товстої кишки контрольних мишей. Крім того, ми оцінили вплив дієти на CXCL12, цитокін, причетний до раку товстої кишки, який може активувати EGFR при інших видах раку. Протокол показаний на рис. 1А. Західна дієта суттєво збільшила транскрипти (рис. 1B) та рівні білка ADAM17, pro-TGFα та K-Ras, а також CXCL12 у дистальній слизовій оболонці товстої кишки (рис. 1C та D). Гібридизація мРНК TGFα in situ показала, що транскрипти переважно експресуються в епітеліальних клітинах товстої кишки (рис. 1E та F), тоді як CXCL12 найбільш поширений у стромальних клітинах (рис. 1G та H). Західні дієти збільшували як рівень TGFα (рис. 1B – F), так і рівень CXCL12 (рис. 1B – D, G та H).

Сигнали EGFR вимагають активності металопротеази та сигналів CXCR4 у західних мишей, що харчуються

Марімастат.

Оскільки ADAM17 та декілька компонентів EGFR збільшувались у слизовій оболонці товстої кишки під час західної дієти, представляв інтерес оцінити роль ADAM17 у цих дієтичних ефектах. Оскільки специфічні інгібітори ADAM17 комерційно не доступні, ми обрали маримастат, інгібітор металопротеази широкого спектра дії, який блокує ADAM17 (26), для оцінки потреби в металопротеазі для сигналів EGFR у мишей, що харчуються західною дієтою. Як показано на додатковій фіг. S3, маримастат суттєво пригнічував сигнали EGFR у слизовій оболонці товстої кишки, з більш ніж 50% зниженням фосфоактивного EGFR (pEGFR), pErbB2 та pERK порівняно із самою західною дієтою. Таким чином, сигналізація EGFR в слизовій ободовій кишці у західних мишей, що харчуються дієтою, вимагає активності металопротеази. Ці результати стосуються ADAM17 і, можливо, ADAM10, оскільки вони є основними ADAM, відповідальними за регулювання вивільнення ліганду EGFR (22).